人类x和Y精子的分离密度梯度离心法.docVIP

人类x和Y精子的分离密度梯度离心法 (一)原理 x、Y精子尽管由平衡沉淀作用获得的密度是相似的，但在分离介质中的沉降速度不等，x精子沉降速度比Y精子快；这样在一个由低到高的密度梯度中，通过适当的离心力作用下，经过一定时间离心，可在不同密度梯度中分离出富含x或Y精子的标本。 (二)试剂与器材 (1)lOxEaIles液； (2)l×Earles液； (3)：Percoll液； (4)Nycoprep(密度为1．15g／mL，渗透压为290mOsm／kg)； (5)14mL离心管。 (三)方法 100％Percoll液制备：9份Percoll+1份10×．Eartes液+100IU／mL青霉素+1．89g／L Nat_IC03，密度为1．11g／mL，渗透压280mOsm／kg。 在使用前一天，将100％Percoll液放在5％c02培养箱中平衡8～10 min，贮存于4cC冰箱；在使用当天，将100％Perc0儿液1000g离心10 min，以沉淀任何二氧化硅颗粒凝集物。然后用l×Eailes液将100％：Pel，coll液稀释成各种所需浓度。 (1)8层Percoll梯度离心法在14mL离心管中，由下至上从84％到35％Percoll液，按7％递减，各加1．0mL，形成7层：Pelcoll梯度；取1．OmL液化精液加入Percoll梯度的最上层，250g离心30 min，移去各层液体，沉淀层用1×Ealiles液(含10％胎儿脐带血清)洗涤，300g离心10 min，去上清，最后沉淀用适量Eat-les液悬浮。 (2)8层Percoll+Nycoprep分离法 在一支14mL离心管中先加入1．0mI．Nyco[Irep液，然后在其上层依次加入各1．OmI．的100％～40％Percoll液共7层，最后，最上层再加入1．0mL的液化精液，250g离心25 min，移去各层液体，沉淀用1~2mLEal·les液洗涤，离心，去上清，沉淀再用适量Ear-les液悬浮。 (3)12层Percoll梯度离心法在14mI．离心管中，由下至上各加0．7mL，按5％递减的80％～：30％Percoll液共11层；取2．0mL液化精液放至4．0mL25％，Percoll层上，250g离心20 min，沉淀的精子用0．7mL 25％Per-coll悬浮，放到上述Percoll层上，250g离心30 min，移去各层液体，沉淀用培养液洗涤、离心后，去上清，沉淀再用适量培养液悬浮。 (四)结果与讨论 Percoll为二氧化硅的衍生物，可被制备成等渗的不同密度梯度，其低粘稠度(10±5CP)使其能够在低速离心下即可获得平衡沉淀。。Kaneko等采用8层Percoll梯度离心法，在精液层与Percoll层交界处收集的精子中Y精子为73．1％士3．3％，而在沉淀层中Y精子仅为27．4％±3．4％；随着Permll液的密度增加，x精子增加了4．4倍，而Y精子仅下降了1．6倍，表明该法更适合x精子的分离；Iizuka等采用8层Percoll梯度离心法在沉淀中获得82％X精子，而采用12层Percoll梯度离心法于沉淀层中获得94％X精子；AndeJsen等采用8层Percoll+Nycopr印分离法于沉淀层中检出Y精子为39．3％土6．5％，认为该法是目前最有效的减少Y精子的方法。虽然通过Percoll梯度离心后产生的精子数量明显低于原精液，但一般整份精液处理后精子仍可达500万到1000万，完全可以用于人工授精或IVF—ET等操作。