免疫荧光技术课件概要.pptVIP

免疫荧光技术 第一节 免疫荧光技术的原理 一、免疫荧光技术的基本原理 二、荧光产生的原理 第二节 荧 光 素 一、荧光色素 二、可用于标记抗体的荧光素 第三节 荧光素标记抗体的方法 一、标记方法： 藻红蛋白及标记方法 二、荧光抗体的质量控制 F／P比值的计算：可按以下公式计算。 F/P克分子比值= (三)荧光抗体的保存 第四节 免疫荧光染色方法 一、直接法 二、间接珐 三、补体法 四、双重免疫荧光细胞化学标记方法 第五节 非特异性染色 的消除方法 一、非特异性染色的重要因素 二、消除非特异性染色的方法 第六节 使用荧光显微镜的 注意事项 第七节 染色标本的保存 及封片介质的制备 一、染色标本的保存 二、封片介质的制备 在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法： 1.一步法双染色方法 先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行染色。 2.二步法双染色方法 先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。 结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。 五、对照试验 为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以下对照试验： (一)直接方法(需设对照试验) 1.标本自发荧光对照 标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光(无与特异性荧光相似的荧光)。 2.抑制试验 可分为二步法和一步方法。 ①二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。 ②一步抑制方法：先将荧光抗体与未标记特异性抗体等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性，此法效果较二步法好，并且简便。 3.阳性对照 将已知阳性标本用直接法免疫荧光细胞化学染色，结果应呈阳性荧光。 (二)间接方法 1.自发荧光对照 同上。 2.荧光抗体对照 标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。 3.抑制试验 同上。 4.阳性对照 同上。 结果：如对照l和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。 (三)补体方法 1.自发荧光对照。 2.荧光抗体对照。 3.抑制试验。 乙补体对照 取新鲜豚鼠血清1:10稀释先作用标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。 5.抑制试验 标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。 6.阳性对照。 1—5结果阴性，6和待检标本阳性时，则为特异性荧光。 组织的非特异性染色的机制很复杂，其产生的原因主要可分以下几点： (1)一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去引起非特异性染色。 (2)抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异性结合。 (3)除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman抗原)，可与组织中特异性抗原以外的相应抗体结合。 (4)从组织中难以提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 (5)抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 (6)荧光素不纯，标本固定不当等。 (7)组织或细胞内某些物质的自发荧光。 (8)染色时间过长，温度过高，冲洗不够甚至在染色过程中标本干燥等原因，都会引起非特异性荧光染色。 应根据产生非特异性荧光的因素，采取相应的处理方法，常用有以下几种： l.衬染法 最常用0.1％～0.05％伊文斯蓝在荧光抗体染色后再染2—5s或用0.05％伊文斯蓝稀释抗体来抑制自发荧光。 将背景的细胞和组织染成红色，与黄绿色荧光形成鲜明对比。 2.荧光抗体 在染色前用SephadexG—25或G-50(用微柱型)以除去游离或聚合的荧光素及未标记的蛋白。 3.胰蛋白酶消化 经常用0.1％—0.05％胰蛋白酶消化，对于石蜡切片不仅可以提高阳性率和阳性强度，而且可抑制非特异性免疫荧光染色。消化时间要根据组织类型，固定液的不同而选择消化时间，如肾