流式细胞仪分析技术及应用.docxVIP

第十七章 c 流式细胞术（ flow cytometry ，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光 光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。 第一节 概述 流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析，带分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。流式细胞术所具有的分析和分选功能主要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理三部分。 一、工作原理 采用激光作为激发光源 ，保证其具有更好的单色性与激发效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合 的标记技术， 保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号 进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析的精确性。 散射光的测定 散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围 360°立体角方向散射的光线信号， 散射光的 强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。流式细胞仪中涉及的散射光信号分为前向散射光（ FS）和侧向散射光（ SS）。 （一）前向散射光 激光束照射细胞时，光以相对轴较小的角度（ 0.5 °～ 10°）向前方散射讯号。在 激光束正前方的检测器为前向散射光检测器，其收集的散射光信号又称为小角散射，对同一个细胞群体， FS 信号的强弱与细胞的体积成正比，因此可以说 FS 是用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性。 （二）侧向散射光 激光束照射细胞时，光以 90°角散射的讯号。与激光束垂直方向的检测器为侧向光 检测器，也称为 90°散射光检测器。其收集的散射光信号主要由细胞的致密性及粒度折射产生， SS信号的 强弱与细胞或其他颗粒形状及粒度成正比。 SS 用于检测细胞内部结构属性，可获得有关细胞内超微结构和 颗粒性质的参数。 二、荧光测量 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不相同。每种荧光染料都有特定的激发波长，激发后又产生特定波长荧光。通过一些波长选择通透性滤光片，可将不同波长的散射光、荧光信号区分开。选择不同的单克隆抗体及荧光染料可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同特征。 三、细胞分选 分选速度：至少达 5000 个 / 秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。 分选得率：是指从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后获得目的细胞的实际得率。该得率与分选的速度密切相关，当分选速度过高，会使部分目的细胞漏检，使得率下降；分选速度降低，目的细胞信号被检时间增加，得率增加。 分选纯度：与仪器的精密度直接相关，同时与被分选细胞与细胞悬液中其他细胞有无相互重叠的生物学特性密切相关。 分选收获率：是指设定通过测量点的分选细胞与实际收获的分选细胞之间的比率。收获率的高低同样与被分选细胞和不选细胞间的生物学特性是否重叠有一定关系。收获率与纯度之问有相对应关系。当被要求分选的细胞纯度高，收获率相对低，当被要求分选的细胞收获率高，其纯度就相对降低。 必威体育精装版各类医学考试课程联系 Q第二节 数据的显示与分析 一、参数 （一）前向散射光（ FS）：反映颗粒的大小。 （二）侧向散射光（ SS）：反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度。 （三）荧光（ FL）：反映颗粒被染上荧光部分数量的多少。 二、数据显示方式 （一）单参数直方图：一维资料中最多使用的图形，由一维参数（荧光或散射光）与颗粒计数构成，反映同样荧光强度的颗粒数量的多少，可用于定性、定量资料的分析。 （二）双参数散点图：双参数散点图是一种细胞数与双测量参数的图形，纵坐标与横坐标分别代表被测细胞的两个测量参数，根据这两个测量参数，就可确定细胞在双参数散点图上的表达位置。 （三）三参数散点图：流式细胞仪的软件技术发展到今天，不少商品化的软件均提供三参数直方图功能，这意味着这一类散点图的三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数。这一立体图以点图为显示方式，同样可以做全方位旋转以便仔细观察。 （四）流式细胞仪的多参数分析：标记了多色荧光的细胞在流式细胞仪上被激光激发后，所得到的荧光信号和散射光信号可以根据需要进行组合分析以获得所需的信息，这就是流式细胞仪的多参数分析。 第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 （一） 新鲜实体组织单细胞悬液的制备：最常用的方法有机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法等方法。 （二）单细胞悬液的保存：最常用的处理方法有三种：深低温保