实验-抗药性突变株-附件(1).pptVIP

大肠杆菌化学诱变处理与抗药性突变株的筛选 实验目的 了解生物基因突变的概念及种类。 掌握诱发突变的操作技术。 1、物理诱变：紫外线、X—射线、γ—射线，快中子 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。 使用化学诱变剂的优缺点： 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。 2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射±行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。 3、生物诱变： 插入序列，转座子，转座phage等。 实验材料 菌种： E.coli 试剂： 0.2M NaNO2 ， 1M HAc缓冲液， 0.7M Na2HPO4 链霉素（Str 100mg/ml） 材料： 牛肉膏蛋白胨培养基 平板 离心管 无菌水 移液器 实验方法 Str 梯度平板的制备 倒10ml 无str的培养基于平皿中，倾斜放置。待凝固后加入10ml 含100ug/ml str的培养基（含有str的培养基需置于55度水浴保温），铺平冷却。 菌悬液的制备 吸取10ml 菌液于离心管中，无菌操作，10000rpm，离心2min。加入等量无菌水溶菌。 NaNO2 诱变 取以上清洗后的菌悬液2ml 于一个已灭菌的大离心管中，加2ml已水浴灭菌过的1M HAc缓冲液和不同体积（0V , 0.05V，0.1V，0.5V）的已过灭菌的0.2M NaNO2溶液作用10min，然后用0.7M Na2HPO4(or 0.1M NaOH )使pH 7.0。 用2ml无菌水将以上菌体清洗3次后，取100ul 涂布于上述的str梯度平板。 待菌液吸收后，于37oC 培养箱48hr. 将平板等分成五个区，完成下表。 * 2、化学诱变：碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。 常用诱变剂： 亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝基胍等 诱变机制 注意事项： 选择适宜的诱变剂及剂量，适当的温度 和PH，终止反应，安全 No. of CFU 0V 0.05V 0.1V 0.5V 5 4 3 2 1 NaNO2浓度 Str 区域