春西南大学基因工程作业全.docxVIP

1：[论述题] 论述题 1、何谓限制性核酸内切酶？写出大多数限制性核酸内切酶识 DNA 序列的结构特点。 答： 限制性核酸内切酶(RE)是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。限制酶的识别和切割位点通常是4～8个bp长度且具有回文序列的DNA片段，主要产生5′突出、3′突出的黏性末端或平端。当一个样本DNA被一个特定的限制酶切割后，可以产生一批相同碱基序列的DNA片段，进而可以用于基因重组、克隆、核酸分子杂交与序列分析 2、什么是Western印迹？它与Southern印迹有什么不同？ 答： Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。 3、什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同? 答： 基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段 的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。 4、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？ 答： 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片断大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从 200bp 至近 50kb 的 DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段 DNA （5-500bp）效果较好，其分辨力极高，甚至相差 1bp 的 DNA 片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的 DNA ，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行 DNA 电泳。 5、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因? 答： 可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。 简答题 1、常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？ 答： （1）限制性核酸内切酶：识别并特异切割DNA碱基序列；（2）DNA polⅠ：催化缺口平移，制备高比度DNA探针；（3）Klenow片段：合成cDNA第二条链，补齐或标记双链DNA3′端；（4）TaqDNA聚合酶：DNA体外扩增(PCR)；（5）逆转录酶：催化合成cDNA；(6) T4DNA聚合酶：聚合补平或标记DNA平末端或3′凹端等；（7）DNA连接酶：催化2条DNA链之间形成磷酸二酯键；（8）大肠杆菌DNA连接酶： 应用于黏端DNA或切口间连接；（9）T4DNA连接酶：应用于黏性或平末端DNA的连接；（10）末端脱氧核苷酸转移酶：给载体或cDNA加上互补的同聚尾、加标记物；（11）碱性磷酸酶：防止载体自身连接、32P标记5′端；（12）T4多核苷酸激酶：5′端磷酸化、5′端标记放射性核素。 2、重组DNA技术常包括哪些基本步骤： 答： （1）分离制备目的基因――分”；（2）切割目的基因和载体――切”；（3）目的基因与载体的连接――接”；（4）将重组DNA导入宿主细胞――转”；（5）筛选并鉴定含重组DNA分子的受体细胞克隆――筛”；（6）克隆基因在受体细胞内进行复制或表达――表”。 3、常用的目的基因的获取方法有哪些？ 答： （1） 制备基因组文库；（2） 构建cDNA文库；（3） PCR扩增目的基因；（4） 人工合成DNA技术。 4、常用的目的基因与载体的连接方法有哪些？ 答： ⑴ 黏性末端连接：将靶基因片段和载体DNA经相同的限制酶分别切割，使它们两端产生相同的黏性末端。然后经黏性末端碱基配对，再经DNA连接酶作用，共价连接成新的重组DNA分子；⑵ 平头末端连接：将平末端的DNA分子在T4DNA连接酶催化下，使DNA分子的3′OH和5′P进行共价结合； ⑶ 人工接头法： 是指利用人工接头加在平端DNA片段的两端，然后用相应限制酶切割人工接头以产生黏性末端，再与带相同黏性末端的载体相连；⑷ 同源多聚尾连接法：在末端脱氧核苷酸转移酶