绿色荧光蛋白基因标记苏云金芽胞杆菌及微量热特性-微生物学专业毕业论文.docxVIP

摘 摘 要 本研究主要围绕构建高效表达的GFP解离载体标记苏云金芽胞杆菌而开展的研究工 作，主要研究结果如下： 1．利用小质粒复制区构建解离载体 利用TrⅢ30的解离区和来源于库斯塔克亚种大小为2062bp的小质粒复制区ori2062 构建解离载体pBMBll25。将该载体电转化到苏云金芽胞杆菌中，解离载体pBMB]125在 编码解离酶的帮助质粒pBMBl200作用下发生解离，消除抗性基因DNA片段。只留下目 的基因以及苏云金芽胞杆菌质粒复制区的重组质粒，将解离后的菌株在无抗性培养基培养 传代40代后仍可检测到解离后的重组质粒。 2．采用不同启动子、不同质粒复制区构建GFP表达解离载体 分别将带有芽胞依赖型启动子Btl-Btll、非芽胞依赖型启动子pr03A和蜡状芽胞杆菌 启动子proB．c的曲片段插入到以不同质粒复制区构建的解离载体pBMBl205， pBMBl206R以及pBMml25上，得到9株以不同启动子、不同质粒复制区的表达GFP解 离载体。将得到的9种GFP解离载体电转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMBl71中， 荧光显微镜镜检显示9株含GFP的苏云金芽胞杆菌重组菌在波长为300rim．510nm的激发光 下可发射绿色荧光。 3．建杀虫晶体基因与咖基因的融合基因 PCR扩增全长加片段融合于去掉终止结构的杀虫晶体蛋白基因的c一端，构建融合 基因。首先PCR扩增去掉终止结构的pr03A—c，)，1AclO片段，用BamHI、SphI酶切PCR 产物插入到解离载体pBMBl205上得到中间载体pBMBl205Ac。同时扩增全长罟疹片段， 将扩增的g咖片段用印矗I消化插入到pUCl9上得到pUCl9G，再利用印hl、BgllI双酶切消 化pUCl9G，回收两端酶切位点分别为Sphl、BglII的gCp片段，将得到的劝，片段插入到 pBMBl205Ac上最终得到重组的融合基因载体pBMB0474。将pBMB0474电转化到BMBl71 中得到苏云金芽胞杆菌重组菌．SDS．PAGE结果显示重组菌可以表达大小约150kDa-160kDa 的GFP融合蛋白。 4．不同苏云金芽胞杆菌基因工程菌的微量热变化 利用生物活性检测器LK．B-2277研究杀虫晶体蛋白含量不同的两株菌YBT一833、 1婚T．833．2．1的热动力学变化，发现菌体合成杀虫晶体蛋白的过程是一个耗能的过程，杀虫 晶体蛋白产量高的菌株向外释放的代谢热少，反之亦然。研究含质粒拷贝数目分别为4、15 的GFP菌株BMB304GFP、BMB315GFP的热动力学变化，发现质粒拷贝数目高的菌株向外 释放的代谢热少，反之亦然。研究含不同质粒复制区构建的GFP解离载体的菌株 BMB0452B、BMB0462B、BMB0472B的微量热变化．证明含小质粒复制区ori2062构建的 解离载体携带外源基因的菌株的代谢热少于以ori44、oril030两种质粒复制区构建的GFP 解离载体携带外源基因的菌株的代谢热少于以ori44、oril030两种质粒复制区构建的GFP 解离载体。 研究还发现含不同启动子驱动GFP的菌株向外释放的代谢热也不同，含芽胞依赖型 启动子Btl-Btll的菌株BMB0462B的代谢热少于含非芽胞依赖型的启动子pr03A菌株 BMBIM63B，含蜡状芽胞杆菌启动子proB．c的菌株BMB0461B的代谢热界于两者之间。根 据蛋白表达量同菌株代谢热的关系从9种GFP表达解离载体中筛选出一种高效表达GFP的 载体pBMB0472用以标记苏云金芽胞杆菌。 5．gt；v基因标记苏云金芽胞杆菌野生菌 将GFP解离载体pBMBlM72以及融合蛋白载体pBMB0474分别电转化到拟步行甲亚 种YBT．1765中，得到标记的野生型苏云金芽胞杼菌YBTl765．72B、YBTl765．74。PCR扩 增结果显示均可从两株标记基因工程菌中得到g加片段，且还可以从YB丁1765．74中扩增出 YBT．1765中没有的crylAclO基因。SDS．PAGE结果显示标记野生菌YBTl765．72B可以表 达大小为27kDa的GFP．但YBTl765．74中检测不到融合蛋白的表达。荧光显馓镜观察结 果表明YBTl765．72B在激发光下可以发射绿色荧光。 关键词：苏云金芽胞杆菌绿色荧光蛋白基因 解离载体标记工程菌微量热 ABSTRACTThe ABSTRACT The dissertation mainly the construction of resolution with green fluorescent protein． research results summarized following． 1．Construction of resolution with smal