慢性应激肝郁证大鼠海马差异表达基因的初步研究-中医基础理论(内经)专业毕业论文.docxVIP

中文摘要中文摘要 中文摘要 中文摘要 证候以中医藏象理论为基础，又指导着临床诊治的实施，因而成为近年来中医研 究的热点。肝郁证是中医肝病的基础性证候，是临床常见的证候之一，具有重要的研 究意义。研究显示，肝郁证可能是由负性心理应激导致高级神经中枢调节机制紊乱而 形成的，涉及到神经、内分泌、循环、消化、免疫、感觉、运动等多系统多方面病理 改变。作为一类复杂证候，肝郁证表现不仅涉及肝本身病变，也关系到全身其它多脏 腑系统的复杂体系。目前对证候的研究只在某些层面上反映了部分已知基因表达产物 (受体、酶、细胞因子以及肽类等)的改变，远未揭示肝郁证的实质。证候的复杂表 现有其物质基础，而这种物质基础最终可能是由于基因水平上的调控发生紊乱。基于 上述认识，本文主要从以下方面进行了初步研究： 1理论研究 随着后基因组时代的来临，在生命科学的研究重点已经从结构基因组学开始转向 功能基因组水平，这种更重视基因功能、更强调相互作用关系和整合的理念，与中医 学的学术特征不谋而合。证候研究作为中医学发展的重点与核心，面对这种契机和趋 势，提出证候基因组学概念非常必要。证候基因组学，是指在证候理论指导下，运用 功能基因组学方法，通过探讨证候，特别是同病异证或异病同证时基因的变异及差异 表达情况，揭示与某一证候形成相关的所有基因及其功能，从整体基因表达的水平阐 明证候的本质。在此基础上，二者相互融合与渗透而产生的新学科，其深入研究有可 能大力推动中医证候学的飞速发展，使之向一个更深层次迈进。因而，证候基因组学 概念的提出是中医证候学研究要更加深入完善的必然发展要求。 2实验研究 为了探讨肝郁证的基因变化的物质基础，本研究利用慢性温和不可预知应激肝郁 证模型，取海马进行mRNA差异表达分析，目的是为了发现与肝郁证密切相关的基因 片段，从而对肝郁证实质和机理进行研究。 动物实验分两批进行，均使用sD雄性大鼠。第一批用于进行基因差异表达的研 究，为尽量消除个体间差异，特选取同窝出生的sD雄性大鼠(200-2 50克／只)6只， 随机分为正常对照、应激模型、应激模型加阿米替林，每组2只。对照组2只群养， 其他二组孤养。第二批大鼠用于进行Northern杂交的RNA转膜，共32只，随机分为 四组，其中前三组每组各8只，与上述三组的分类、喂养、刺激、给药方法相同。第 四组为模型+逍遥散组共8只：造模同模型组，将灌胃改为逍遥散(1 0ral／kg．浓度 1．9 29／m1)。孤养。两批饲养均在允许时自由摄取食水。 造模21天后，末次处理的24小时后，快速断头处死，冰上取脑，分离海马，液 氮冻存备用。然后用TriZOl试剂一步法提取模型大鼠海马总RNA。首先以GENOMYX 公司的flooroDD试剂盒，选取3’端锚定引物和5’端随机引物配合进行反转录 (Rever se Translati011)，然后以原引物对相互配合进行PCR反应。经荧光标记后， 电泳分离出与空白对照组表达有差异的基因条带共18条。将这些差异条带小心回收 并连接进入T—easy质粒DNA载体，然后转化进入大肠杆菌，经克隆后进行测序、登 慢性应激肝稚证大鼠海马差异表达基因的初步研究陆和检索。相似性搜寻，结果显示，其中有5个片断经Genbank检索、分析与已知的 慢性应激肝稚证大鼠海马差异表达基因的初步研究 陆和检索。相似性搜寻，结果显示，其中有5个片断经Genbank检索、分析与已知的 基因有相似性，它们是：2、3号条带与AFl63321，即大鼠中枢神经系统中的腹侧正 中线抗原(dentral midline antigen，VEMA)的序列具有高度相似性，可能是该序 列的一部分，其所表达的蛋白可能在调节哺乳动韧的轴突导向(regulating axofl guidance)方面发挥重要作用；9号条带与大鼠Palmitoy卜protein thioestera se (Ppt)、4、1 0号条带与大鼠异柠檬酸脱氢酶、12号与大鼠唾液酸转移酶9 (sia LYltlansfera se 9)、8号与Hippocampus cDNA(AK01 3739)有高度相似性。其 余条带均未与已知基因有相似性，部分在GenBank数据库上进行的登陆，接受号分别 为：5号登陆号为BQ543229；6号登陆号为BG4129 55；7号登陆号为BG874242；1l 号的登陆号是IIQ543228；1 3号的登陆号是BM958512；14号的登陆号是BM958511； 1 5号的登陆号是BM968513；16号未得到克隆；1 7号的登陆号是BM958 51 o；18号登 陆号BQ258377；1号未登陆。 为了对差异显示的基因片段进行验证，我们又以32P同位素标记DNA探针，与海 马总RNA进行了No