准备PCR反应进行PCR反应判读.pdf

Venor GEM簡易 操作 手冊 流程 置備 DNA檢體 準備 PCR 反應 進行 PCR 反應 判讀 A.檢體 DNA: I. 檢體來源 : 各種分泌物或擦拭檢體或 其他如組織及培養的細胞等均可. II. 純化 DNA 使用適當的 DNA 純化試劑組純化 DNA B. 準備 PCR 反應 1.. Venor GEM試劑 原廠試劑組有 : 紅頭管: Primer/Nucleotide Mix (乾躁包裝含 ) 。綠頭管:Positive control DNA 乾躁包裝( ) 。黃頭管 :Internal Control DNA (乾躁包裝 ) 。白頭管 :PCR級的純水。 藍頭管 :PCR反應緩衝液 (500ul, 10x PCR reaction buffer,適用MB TAQ DNA Polymerase) 。***注意若您的: Taq polymerase非MB Taq polymerase (cat #53-0050, 53-0100, 53-0200, 53-0250) ，請使用Taq polymerase製造商提供的 Buffer 。 原廠是乾躁試劑包裝 ,故第一次使用時請依下列驟 : - 以桌上型 13000rmp 離心機-最高速離心 5 sec - 加入 去離子DNA-free water, 如下 : primer/nucleotide mix (per portion of 25 reactions) 65 μl (紅頭管) positive control 300 μl (綠頭管) internal control 300 μl (黃頭管 ) - 適溫靜置 5 minutes -簡易震盪並最高速離心 5 sec (注意: 加水之後請保存于-18℃) 2.設定 PCR 機器 1 cycle 94°C for 2 min 39 cycles 94°C for 30 sec 55°C for 30 sec 72°C for 30 sec, cool down to 4 to 8 °C 3. 準備 PCR 反應試劑 (每一PCR 反應體積為 25 ul,請依下表混合 ) Table 1: examples for pipetting schemes For 1 reaction For 5 reactions For 25 reactions Taq Pol. (5 U/μl) 0.2 μl 1.0 μl 5 μl internal control (yellow 2.5 μl 12.5 μl 62.5 μl cap) primer/nucleotide mix (red 2.5 μl 12.5 μl 62.5 μl cap) 10x reaction buffer (blue 2.5 μl 12.5 μl 62.5 μl cap) 去離子水- DNA-free 15.3μl 76.5μl 382.5μl DNA 檢體 (每反應2μl) 2μl 10μl 50μl 4. 判定結果 Band pattern 判讀 191bp的 PCR 產物 無 Mycoplasma pneumoniae感染 270bp 及 191bp的 PCR 產物 輕微 Mycoplasma pneumoniae感染 很明顯的 270 bp PCR 產物 高度 Mycoplasma pneumoniae感染 無PCR 產物