鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株细胞克隆化毒在回鸡过程中致病性与VP2基因变异比较-预防兽医学专业论文.docx

朱瑞良 朱瑞良 vvIBDV细胞克隆化毒在同鸡过群中致病性与VP2基冈变异比较 鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株细胞克隆化毒 在回鸡过程中致病性与VP2基因变异比较 研究生： 朱瑞良 指导教师： 崔治中教授 摘 要 传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以侵 害雏鸡中柄免疫器官中的法氏囊为t要特征的传染病。1957年该病首次在美 国特拉华州的甘布罗镇(Gumboro)的肉鸡群中发生。最初分离到的病毒发病 率高，但致死率通常在2—5％，偶尔20—30％，这种病毒株称之为标准毒IBDV (vlBDV)。二十世纪80年代后期，美国出现了与标准毒在抗原性上有明显差 异的变异株。欧洲国家首先报道了致死率高达90—100％的超强毒(vvIBDV)， 90年代初传至中幽及亚洲其它地区。vvIBDV感染现已遍布于全球丰要养禽地 区，在工、lk化养鸡业发达的国家尤为严重，鸡群感染vvlBDV后，除直接引起 死亡外，还可使雏鸡产生免疫抑制，导致机体的免疫防御能力降低和多种疫 苗免疫失败，给养鸡业造成了巨大的经济损失。 随着分子病毒学技术的普及，包括中国在内的世界上许多困家不同实验 室都对vIBDV、vvlBDV及变异株IBDV的VP2基冈的高变区的核苷酸序列 和氨基酸序列做了比较。最初发现所有的vvIBDV都有一些叫‘能与致病性相关 的氨基酸变异，但近年来也有学者认为，vvIBDV相关的VP2高变区的氨基酸 有规律变异只是病毒演化过程中的一种普通的遗传标志，而不是与致病性相 关的遗传标志。由此看来仅靠未经纯化克隆的由同种病毒不同亚群 (quanspecies)组成的不同野毒株分离物的VP2基因的比较，无法回答这个 问题。本课题试图将一个vvIBDV中国株在细胞培养上克隆化后，再返回SPF 鸡连续传代，通过比较若干病毒克隆返鸡后不同代次的传代毒致病性与VP2 基因变异，来从另 个角度验证VP2高变区变异是否与致病性有关。 在实施国家自然基金重大项目的过程中，本人所在实验室从全国30个省 市已经收集了72株IBDV株，在对其中40株IBDV株进行毒力、血清学以 及致病性检测的基础上，选择一个毒力最强的、致死率高达90％的vvlBDV Gx8／99株作为本课题研究的起点。将vvIBDV Gx8／99株通过传代，研究从原 始毒(鸡源囊毒)一鸡胚毒一细胞适应毒一细胞克隆化毒一回传SPF鸡传代 b b 扬州1人学博十学位论文 毒(鸡源毒) ‘个轮回过程中系列毒株致病性的变化规律及其与核苷酸、氨 基酸变异之间的关系。初步掌握了vvIBDV在整个传代循环过程中的致病特 点，研究了vvlBDV从未经克隆的病毒的“群体致病性”到克隆化病毒的“个 体致病性”的变化规律。引进这一方法将有助丁揭示vvIBDV的演变规律和毒 力改变的分子基础，有助丁解决超强毒毒力如何增强?超强毒能台致弱?敏 弱过程中核苷酸和氨基酸序列发生了怎样的变化?这种变化与病毒生物学特 性有着怎样的关系?弱毒株的生物学特性如何等急需解决的问题。 本课题主要研究内容及其研究结果包括如下几个方面： 1．鸡传染性法氏囊病病毒超强毒GX8199株传代培养及病毒的克隆化：本研究 将vvlBDV GX8／99株首先在SPF鸡胚上传10代，然后在鸡胚成纤维细胞 (CEF)上盲传22代，开始适应CEF，并引起细胞病变(CPE)，表现为细胞 聚缩、拉成纤丝状，最后变圆、脱落。再经无限稀释法进行2次病毒的克隆 化，筛选得到了4株克隆化病毒。以克隆化病毒为起点，再将这4株克隆化 病毒分别连续回归3～5周龄SPF鸡连传15代。各传代毒通过免疫胶体金试 纸膜检测，除CEF适应之前的细胞毒检测不到IBDV外，其余各传代毒均可 检测到IBDV。vvlBDV GX8／99株不同代次传代毒的获得，为研究该病毒从原 始毒(鸡源囊毒)一鸡胚毒一细胞适应毒一细胞克隆化毒一回传SPF鸡传代 毒(鸡源毒)一个轮回系列毒株致病性的变化规律及其与核苷酸、氨基酸之 间的关系，更好地掌握vvIBDV在整个传代循环的过程中的致病特点，vvlBDV 从“群体致病性”到“个体致病性”的变化规律建立了新的技术平台。 2．鸡传染性法氏囊病病毒超强毒GX8／99株原始囊毒及其传代毒的致病性试 验： IBDV GX8／99株系1999年从广西一自然发病鸡群采集到的法氏囊组织 中分离到，经动物实验证明为～超强毒。即用原始病鸡法氏囊悬液在SPF鸡 连续三次人工感染后，再取法氏囊制备悬液分装在．700c保存，并用8日龄SPF 鸡胚经卯黄囊接种