鸡新城疫、鸡传染性支气管炎基因芯片的构建及其检测技术研究-预防兽医学专业论文.docx

中文摘要中文摘要 中文摘要 中文摘要 鸡新城疫(Newcasttle Disease，ND)和鸡传染性支气管炎(Infectious BronchitiS，IB)是鸡的主要呼吸道传染病，严重危害养鸡业的发展。基因芯片技术 是近年来发展起来的一种生物新技术，该技术可应用于基因表达谱分析、基因位点突 变分析和疫病检测等方面。本研究首次构建制备了NDV—IBV基因检测芯片，建立了检 测NDV、IBV基因芯片检测新技术，该技术对NDV、IBV的检测具有同步检测和鉴别诊 断的功能，是动物疫病病原检测方法新的突破和进步。本研究的主要研究内容包括以 下三个方面： 1、NDV-IBV检测基因芯片的靶基因克隆及鉴定研究 对NDV和IBV等病原进行分子生物学特征分析，根据文献和GenBank中报道NDV、 IBV、AIV和IBDV的基因序列，用DNA Club2．0或Arraydesigner 2．0软件设计了5 对NDV靶基因引物、4对IBV靶基因引物、2对AIV和1对IBDV对照靶引物。试验以 NDV Lasota株、NDV F48E9株、IBV M41株、IBV SM株、IBD中等毒力疫苗株和AIV 株为材料，用RNA／DNA抽提试剂盒抽提病毒RNA，反转录合成cDNA。以eDNA为模板， PCR扩增获得了5个NDV靶基因、3个IBV靶基因、2个AIV基因和1个IBDV基因， 分别命名为NDI、ND2、ND3、ND4、ND5、IBI、IB2、IB3、A11、A12、IBDI。其中NDl 系NDV HN基因片段，长487bp；ND2系NDV NP基因片段，长135bp；ND3、ND4系 NDV L基因片段，分别长334bp和540bp；ND5系NDV F基因片段，长522bp； IBI 和IB2系IBV NP基因片段．分别长276bp和lOlObp：IB3系IBV M基因片段，长 315bp：1个未鉴定基因wZ， 长为364bp：All系AIV M基因片段，长789bp；A12 系AIV NP基因片段，长522bp：IBDI系IBD VP3基因片段，长428bp。同时用pMDl8-T Vector载体成功地克隆筛选出T／NDI(F48E9)，T／ND2(Lasota)，T／ND3(Lasota)， T／ND4(F48E9)，T／ND5(Lasota)，T／ND5(F48E9)，’r／IBI(SM)，T／IBl(M41)， T／IB2(SM)，T／IB3(M41)，T／WZ，T／AIl，T／A12，T／IBDI等14个重组质粒，经 BamH l酶切、PCR和核酸序列测定鉴定了克隆重组质粒，为NDV—IBV检测基因芯片的 构建和制备提供了确实可靠的靶基因材料，是NDV-IBV基因检测芯片构建的关键技术 之一。 2、NDV-IBV检测基因芯片构建研究 本试验对基因芯片的制备、探针制备和基因芯片检测方法进行了研究，构建了 NDV-IBV检测基因芯片和初步研究了NDV强弱毒鉴别基因芯片。 (1)基因芯片的制备以靶基因重组质粒DNA为模板，经PCR扩增、异丙醇沉淀 纯化靶基因。同时以^DNA模板和设计引物经PCR扩增制备了长为500bp的定位基因， 四川农业大学博士学位论文靶基因和定位基因浓度为161．88-1218．36ng／u 四川农业大学博士学位论文 靶基因和定位基因浓度为161．88-1218．36ng／u l。用基因芯片点样缓冲液将靶基因 和定位基因稀释成一定浓度后，基因芯片点样仪SpotArray 24点样制各芯片。芯片 基片为氨基化基片，点样参数为样点中心间距450u m，样点直径220uIn，点样后室 温干燥2hrs、水合处理lOs、紫外线交联25min．和0．2％SDS洗涤5min．等系列处理， 制备了NDV—IBV检测基因ji!；片。 (2)基因芯片探针制备 以cDNA为模板，经PCR扩增标记荧光素CY3制备探针。 PCR扩增标记体系中，CY3一dCTP的使用终浓度为4．0“M，dCTP的终浓度为100．011 M， 其他dNTP的终浓度为200．0 u M，制各的探针经试剂盒纯化后浓度为39．09—145．76 rig／“l之间。 (3)基因芯片的检测方法及分析试验确定了基因芯片检测技术流程和主要参 数。芯片经95—100℃变性卜2min．后用无水乙醇快速冷却，离心干燥，在44℃下预 杂交30min．一60min．，探针95℃变性5min．，冰浴急冷后加杂交缓冲液配成杂交液， 取25—30 u 1用于芯片杂交，在一定温度下杂交时间为7-9hrs。然后用洗液1(2．O％SSC 0．I％SDS)、洗液2(0．2％SSC 0．1％SDS)、洗液3(0．16％SSC 0．1％SDS)先后洗涤1次，每 次3-5min．洗涤后离心干燥，芯