第五章 基因的定点突变 .pptVIP

第七章 基因的定点诱变 一、传统的诱变 利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体 射线（紫外线、X射线、γ射线等） 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等） 不足： 生物体的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难 即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上 在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质 二、基因定点诱变 定点诱变（site-directed mutagenesis): 在体外特异性改变某个碱基的技术 研究基因的结构与功能的关系 获得所需功能的突变体蛋白质 1. 寡核苷酸盒式诱变 Cassette mutagenesis 利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列 2. 寡核苷酸引物诱变 ①基本原理： 使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列 作为诱变剂的寡核苷酸序列： 人工合成一段8~18个碱基的寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补 错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子的中央部位 通常采用化学合成 ②基本步骤： 将待突变的目的基因插入M13噬菌体载体，制备单链DNA 将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNA 将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变基因 突变体的筛选：寡核苷酸探针杂交筛选法 局限性：突变体子代频率低 退火时，有些单链模板DNA未与寡核苷酸配对 细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新合成链中的错配碱基 ③ 改进的硫代磷酸诱变法 有一些限制酶如AvaI, NciI, PstI等无法切割硫代磷酸DNA 第二节 基因的直接进化技术 Directed evolution （直接进化或定向进化） 对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，从而实现在试管中分子水平的模拟进化。 基因直接进化的步骤 突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的活体或离体筛选 随机突变的策略： 1. 易错PCR（error-prone PCR） 在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变 2. DNA shuffling （DNA 重排或改组） DNA shuffling 是指DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能 基本步骤: 目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因 DNaseI酶切：将基因随机切割成约50～100bp左右的小片段 不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组 加引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物, 使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。 突变基因的表达与筛选 Phage display of random peptides Phage display technology Expression of exogenous proteins, peptides or peptides libraries on the surface of phage M13, T7 Phage Display Express cDNA as fusion protein on cell surface 噬菌体显示的筛选模式 基因直接进化的用途 提高酶活性 改变底物特异性 改善酶的稳定性 获取具有新功能的酶 提高药用蛋白和疫苗的活性 改善整个代谢途径 * * 第一节 基因定点诱变 Higuchi, 1988 Four primers, three PCR 3. PCR诱变 Sarkar and Sommer 1990 Three primers Two rounds of PCR Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment