检疫性实蝇mtDNA种特异引物PCR鉴定技术的研究-动物学专业论文.docxVIP

串垂大学鞭圭学位论文 串垂大学鞭圭学位论文 零孛平 检疫性实蝇mtDNA种特异引物PCR鉴定技术的研究 专 监：动扬学 硕士生：邓中平 导 师：张润杰教授 摘要 实蝇属于双翅目实蝇科，已撼述的种类超过450属4300余狩，约有70莉 被认为是农业上的重要害虫，其中地中海实蝇Ceratitis capitara、南美按实 撼Anastzepha fT菇teroU]US．嬉小实蝇Bactrooer8 dorsalis等40多手孛实蝇是 我国植物检疫禁止进境的危险性害虫。本研究以国内外植物检疫普遍关注的地 中海实瞧秘我莺踞岸梭痰截获频次最高懿9静莱实筵：捂，J、实髓、寒瓜实蝇矗 papayae、杨桃实蝇丑ca．rambolae、菲樟宾实蝇置肋Hippinensis、芒果实 蠛拉occipitalis、辣椒实蝇武]atifrons、瓣石稽实蚝最COTrect8、南瓜 实蝇显蕊ugodacus)tau和瓜实蝇显像，cucurb]tae等为研究对象，通过筛 选分子标记基因，经基因组DNA提取、通用引物PCR扩增、目稀序列测定和序 列拢对分孝厅，自行设计、薅选秘特异引物，在戴建首次建立了炔速检测鉴定实 蝇的种特肄引物PCR方法(species—specific primer PCR，SS-PCR)。 奉磺究建立了室爨小援模键莠穗，l、实蟪兹麓镬方法，著以镄莠戆 新鲜实蝇为材料，摸索出一种DNA快速提敬方法～一煮沸法，它适合 予日岸瑗场裣疫滋实际需要。通过对于标本、酒精浸锈标本和福尔马林浸 制标本等不同方式保存的实蝇标本的基因组DNA提取实验，得出在冰乙醇中保 存的实蝇标本的DNA提取获得率最高的结果。 选择线粒体绷腿色素氧化酶I基因(mtDNA-COI)为靶序列，用通煺引物 UEA7／UEAl0分别测定了25种检疫性实蝇mtDNA-COI基因序列35条，总长约 20，000bp，部分序歹g已鞍入Genbank(登记号为：AY530890-AY530906，AY398748- !坐茎兰塑兰兰望篓苎 !坐茎兰塑兰兰望篓苎 登主! AY398758)。用于序列分孝疗的片段长度为648bp，对35条实蝇COI序列分拆表明： 1、序列中A+T平均含量为65．1％，密码子第3位点的A+T平均含量为80．8％， A+T毫含爨隧及G雪量少簿A含爨最毫方嚣均与其它基虫静DNA廖列类似；密码 予第3位点的A+T高含爨与碱基的变异存在一定的相关性。本研究中地中海实 蠛弱A+T含量最离(91+8％)，受属Zeugodacus平均含爨(82．2蔼)略麓予翌藩 Bactroce．ra平均含量(81．3％)。2、多态位点247个，占总序列的38．1％，包括 特有多态位点43个，简豹信惠位点204个。3、共有297次发生核瞢酸突变， 其中同义突变数为265，异义突变数为32；核苷酸多样憷pi值为0．1121，平均 核苷酸差舜数K值为72．6590。4、由序列变异计葬了Kimura一双因子遗传距离， 憨体平均遗传距离为0。1251；蟪中海实蠛(ceratitis属)与不同属阕瓣遗捷 距离从0．1408(与Zougo如Gw豫属南瓜实蝇之间)至0．2296(与愚阳￡打dacus 强瘸平震实殛量expandens之瘸)；辖，l、实撬复合静中豹5令残燕之阕豹遗转距 离从0．0062(来源于日本的桔小实蝇与杨桃实蝇之间)至0．0352(来源于上海 的旗，，j、实褥与芒崇实蝇之润)；Zeugodacus亚属中瓜实蝇与南瓜实蝇之闻的平均 遗传距离为0．0432。5、除芒果实蝇外，其它24种实蝇的COI基因编码强白序 判均由19种氨基蔽组成，缺少半胱氨酸。通过mtDNA—COI基因部分序列的分析， 能较好反映出属间和种闻的亲缘关系。 自行设计引物，通过引物特舁性验证、灵敏度检测、实蝇不同地理种群和 不恳虫悫橛本应髑实验以及PCR产物测序验证，薅选获穆灵敏震裹、特努毪强、 准确可靠的种特异引物13对；通过反应退火温度、DNA模板浓度、引物浓度、 麓g”浓度、dRTP浓褒等反黩条舞翻爱应俸系优讫，使掰有实筑PCR扩增反应条件 和反应体系一致，操作简便快速，结果明确可靠，建立了快速检测10种实蝇的 SS—PCR检测方法。 SS～PCR检测方法不但适合于实蝇成虫的快速检钡l，还适用于卵、幼虫和蠛 等不同虫态的快遮检测，它不受样品存活状态、样品数量和样品是否完憋的限 制，使传统的实蠛捡疫鉴定时超从20多天缩短垩l《8小时强内，解决了遴蹩凌 植物检疫梭测周期长的实际问题。 关键词：梭疫性实蝇；鉴定；mtDNA—C01；种特界引物；SS．PCR 珏 李出太攀鹾士学筏谑文 李出太攀鹾士学筏谑文 蓐孛警 Studies on Identification of Quarantine Fruit Fl