炮制方法对延胡索乙素含量和镇痛作用的影响.DOC

炮制方法对延胡索生物碱含量及其镇痛作用的影响 综合一体化实验 林亲雄 陈旅翼 编写 一、实验项目拟达到的学生训练目的或目标 1.掌握延胡索炮制方法、要点及原料； 2.掌握延胡索生物碱成分及镇痛药理作用测定的方法； 3.了解炮制前后延胡索生物碱含量与镇痛药理作用变化的意义。 二、实验项目涉及的主要科学原理 1.延胡索的炮制及增效原理：按照2010年版《中华人民共和国药典》延胡索项下的炮制方法、采用醋炙法炮制延胡索，增强其行气止痛作用。其有效成分为难溶于水的生物碱，醋炙后可使生物碱成盐，易于溶出。而生物碱又为其镇痛有效成分。故醋炙后，延胡索的生物碱提取率和镇痛作用均能增加。 2. 延胡索生物碱成分的HPLC测定：延胡索的主要活性成分是生物碱类成分，具有显著的镇痛、镇静和催眠作用，对心律失常、胃溃疡等多种疾病有较好的临床效果。通过HPLC方法比较分析醋炙前后延胡索主要生物碱成分的变化，可为阐明醋炙增效理论提供科学依据。 3.镇痛实验原理：采用小鼠腹腔注射0.4%的醋酸溶液，引起扭体反应；采用热板法，引起舔后足反应；设置空白组，阳性组、给药组，以反映延胡索的镇痛作用。 三、实验项目需要的主要器材 1.实验器具 炒锅、锅铲、煤气灶、搪瓷盘、切药刀、标准筛（50目，即三号筛）、高效液相色谱仪、分析天平（1/100000）、水浴锅、容量瓶（10ml、5ml）、圆底烧瓶（50ml）、平底烧瓶（100ml）、移液管（25ml、50ml）、回流及回收装置、烧杯、玻璃漏斗、锥形瓶、量筒、注射器、微孔滤膜、微量进样器、流动相过滤装置、 HPLC仪。台式天平、烧杯（1000ml）、秒表、小鼠笼。 2.实验材料：延胡索、米醋、甲醇（分析纯和色谱纯）、浓氨水、0.1%磷酸、三乙胺、蒸馏水、生理盐水、0.6%醋酸溶液、苦味酸（动物标号用）延胡索乙素对照品。 3.实验动物：健康成年ICR雄性小鼠（18～22g）。 四、实验内容与方法 1.延胡索的炮制 （1）延胡索预处理：取原药材，除去杂质，大小分开，洗净，稍浸，润透，切厚片，干燥，筛去碎屑，或洗净、干燥后捣碎。 （2）醋炙延胡索：取净延胡索或延胡索片，称重，加入定量的米醋拌匀，闷润至醋被吸尽后，置炒制容器内，文火加热，炒干，取出晾凉。称重，计算得率。 2 醋炙前后延胡索主要生物碱成分的含量测定 2.1 醋炙前后延胡索总碱样品的制备 延胡索生品溶液的制备：取延胡索生品干燥块茎20.0g，粉碎过筛，取4.0g药材粉末用ph3.5（醋酸调）75％乙醇液120.0ml溶解，置于超声波清洗机（40℃，500w）超声40min，抽滤液，渗滤液减压挥去乙醇（55℃），用蒸馏水定容至100ml，用10%氨水调ph至10.0。用乙醚1:1萃取三次，合并乙醚相，减压挥干（40℃），加20ml甲醇使溶解，最后定容至25ml。取已定容25ml乙醚萃取物中的8ml蒸干，残渣加2ml甲醇超声溶解，用0.45um过滤即得样品A。 延胡索炮制品溶液的制备：同延胡索生品溶液的制备。 对照品溶液的制备：精确称取原阿片碱、延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱四种对照品甲醇超声溶解，用甲醇稀释成1mg/ml的溶液。 2.2 HPLC色谱条件与系统实用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH 6.0） (55：45)为流动相，检测波长为281nm。理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3000。梯度洗脱程序由学生自行探索。 标准曲线的制备和测定：将对照品溶液按照不同的比例进行稀释，精密吸取各不同稀释倍数的对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按照标准曲线的测定方法，进行测定，制备标准曲线。 样品测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，根据标准曲线计算含量。 3．醋酸扭体法比较延胡索炮制前后的镇痛作用 （1）供试品溶液的制备 取延胡索生品及醋炙品各25g，分别煎煮，第一次加水400ml，第二次加水250ml煎煮2次，每次25分钟，滤过，合并滤液，浓缩至50ml备用。 （2）试验方法 取小鼠随机分为3组，每组4只，分别灌以生理盐水和延胡索生品供试液、延胡索醋炙品供试液0.2ml/10g，40分钟后，各鼠腹腔注射0.6%醋酸0.1ml/10g，注射后立即启动秒表，记录扭体潜伏期及0～15分钟、15～30分钟的扭体次数。 4．热板法比较延胡索炮制前后的镇痛作用 (1) 供试品溶液的制备 取延胡索生品及醋炙品各25g，分别煎煮，第一次加水400ml，第二次加水250ml煎煮2次，每次25分钟，滤过，合并滤液，浓缩至50ml备用。 （2）把小鼠放在事