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ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA 9—2018 猪圆环病毒I 型微滴式数字PCR 检测方法 Method of Droplet Digital PCR for Detection of Porcine Circovirus Type 1 2018 - 10 - 24 发布 2018 - 10 - 24 实施 中 国 兽 医 协 会 发 布 T/CVMA 9—2018 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、北京市动物疫病预防控制中心、浙江省动物疫病预 防控制中心。 本标准主要起草人：董浩、宋晓晖、王传彬、杨林、辛盛鹏、原霖、吴贇竑、胡冬梅、张硕、梅力、 李硕、王睿男、高晓龙、毕一鸣、蒋菲、张红丽、王静、冯肖肖、陈亚娜。 I T/CVMA 9—2018 猪圆环病毒I 型微滴式数字PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒I型(Porcine circovirus type 1，PCV-1)微滴式数字PCR检测方法的试剂 与耗材、仪器与设备、操作步骤、结果分析。 本标准适用于猪圆环病毒I型核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 微滴式数字PCR （Droplet Digital PCR，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分 成数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR的一次检测变成数万次检测，提高了 检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不 含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上进 行终点PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号 的微滴判读为0。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。 4 试剂与耗材 4.1 提取试剂 宜选取商品化的病毒DNA提取试剂盒。 4.2 微滴式数字PCR 扩增试剂 宜按照不同的微滴式数字PCR平台的说明书选取推荐的微滴式数字PCR扩增试剂。 4.3 引物和探针 PCV-1 上游引物(PCV-1 F) ：5 ＇- AGCCAGTGGGCCCGTWAT-3 ＇ PCV-1 下游引物(PCV-1 R) ：5 ＇- TCCCAAGGTAACCAGCCABAA-3 ＇ PCV-1探针 (PCV-1 P) ：5 ＇-FAM- TTGCTKAGCCTAGCGACACCTAYTGGAA-BHQ1-3 ＇ 1 T/CVMA 9—2018 5 仪器与设备 生物安全柜、PCR扩增仪、数字PCR微滴发生器、数字PCR微滴分析仪、纯水仪、核酸定量仪、涡旋 震荡仪。 6 操作步骤 6.1 样品采集及运输