epb41l3在食管鳞癌中发挥抑癌作用并影响预后的功能及其机制研究肿瘤学专业论文.docxVIP

博士学位论文突变发生率更高。CpG岛的异常甲基化将导致基因沉默，使抑癌基因失活。接 博士学位论文 突变发生率更高。CpG岛的异常甲基化将导致基因沉默，使抑癌基因失活。接 着，抑癌基因又可以通过阻断许多正常的细胞通路，如凋亡或细胞周期等，造 成肿瘤加速生长。在肿瘤细胞中有成百上千个基因发生甲基化，而突变基因则 只有几十个。通过DNA甲基化导致基因失活并促进癌变的表观遗传沉默，表明 DNA甲基化能够明确影响正常细胞走向癌变的进程。总的说来，肿瘤组织中有 两种DNA异常甲基化的情况，包括广泛低甲基化和局部高甲基化。前者可使原 癌基因活化，形成突变热点，增加染色体的不稳定性，使转座子异常表达；后 者则直接或间接影响基因转录，也可导致胞嘧啶一胸腺嘧啶突变。目前对于基因 的DNA甲基化造成抑癌基因失活从而如何影响肿瘤癌变进程正成为新的研究热 点。 EPB41L3又名4．1B、Dal．1，是一种属于4．1家族的重要膜骨架蛋白，在人 类多种组织器官中广泛表达。与此相对的是，越来越多的研究发现EPB41L3在 多种肿瘤中呈现异常表达。如在食管鳞癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胶质瘤、 脑膜瘤、肾透明细胞癌等多种肿瘤组织中，EPB41L3的表达均较正常组织发生 下调。Yajie Zhang等发现在超过71．4％的非小细胞肺癌细胞和临床组织中下调； Kittiniyom Kearly等报道在乳腺癌肿瘤组织中也出现其表达缺少，且大约三分之 二的导管原位癌和侵袭性导管癌中都出现了这一情况；Bernkopf等研究得出 EPB41L3在前列腺癌中表达缺失的结论，并提示若上调其表达可有助于治疗前 列腺癌；Daisuke Yamada等在肾透明细胞癌中发现EPB41L3常发生甲基化，它 的检出，可能成为手术切除后复发转移的独立的预后预测指标。总的说来，目 前已有的报道证明了EPB41L3可能在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用，它的甲 基化与肿瘤发生和预后较差相关。然而，目前在食管癌中还没有类似研究的报 道。揭示EPB41L3在食管癌中是否因为甲基化而无法发挥抑癌基因的作用，并 对肿瘤癌变过程起到哪些影响，当中又牵涉到哪些分子生物机制是我们关心的 问题。 我们的既往研究发现肿瘤组织中的基因EPB41L3甲基化率明显高于相应的 万方数据 摘要正常组织。食管癌组织中的甲基化率为59．5％，临近正常组织中则为4．8％，P 摘要 正常组织。食管癌组织中的甲基化率为59．5％，临近正常组织中则为4．8％，P 值为0．000。EPB41L3的启动子区域有13个CpG位点发生甲基化，食管癌组织 比正常组织中EPB41L3表达下调超过10倍。而且甲基化率与肿瘤大小相关，大 的食管癌肿瘤组织中的甲基化率比小的肿瘤组织中要高。深入分析患者的病理 资料后，发现有77．8％的pT3样本发生了EPB41L3的甲基化，而pTl．pT2样本 中则为26．7％。这提示我们EPB41L3可能因为甲基化在肿瘤中发生沉默，并在 肿瘤发生进展中起到关键作用。 虽然上述提到的研究结论可将EPB41L3与食管鳞癌的发生与进展联系在一 起，但EPB41L3在食管鳞癌细胞中的具体表达状况以及是否发挥抑癌作用和相 应的机制尚不明确，还需要进一步深入研究。本课题旨在探究EPB41L3在食管 鳞癌中发生甲基化和抑制肿瘤发生发展的作用及其机制。鉴于局部进展和远处 转移是食管鳞癌病人的主要死因。进行外科手术和放化疗治疗后，食管鳞癌病 人的五年生存率仍然低下。如何早期检出食管鳞癌患者，如何提高治疗疗效， 如何开发新的有效的分子靶向药物是医学界面临的难题。有研究表明未来可能 有多种分子标记物用于进行食管鳞癌病人的早期检测、预后评价、新药研发。 这无疑是个令人振奋的消息，因为我们也侧重研究了病人的病理资料与 EPB41L3表达之间的关系，这为今后EPB41L3在临床的应用，打下了坚实研究 基础。 二、研究方法 1细胞培养与处理 Hetla、TEl、KYSEl50、KYSE450、KYSE510细胞使用RPMI．1640，Ecal09、 Caesl7细胞使用高糖DMEM，均分别添加10％胎牛血清，将细胞培养箱的温度 设置为37。C、C02为5％的浓度，相对湿度为50％，之后根据细胞的生长速度更 换培养基，一般为l一2天，用含有O．25％胰蛋白酶以及0．02％EDTA的胰酶工作 液消化并使细胞分散，进行传代或接种培养。 2侵袭试验 IV 万方数据 博士学位论文将细胞培养至良好状态，传代至24或12孔培养板，按常规细胞培养流程 博士学位论文 将细胞培养至良好状态，传代至24或12孔培养板，按常规细胞培养流程 过夜培养，待细胞生长到处于对数生长期，细胞融合密度达80％左右时，采用 invitrogen公司的转染试剂Lipofectami