泛素结合酶ube2t在鼻咽癌发生发展中的作用及其机制探讨放射肿瘤学专业论文.docxVIP

博士学位论文本研究试图探讨UBE2T与鼻咽癌患者恶性特征及预后间的相关性，及其对 博士学位论文 本研究试图探讨UBE2T与鼻咽癌患者恶性特征及预后间的相关性，及其对 鼻咽癌细胞增殖、侵袭及转移的影响和可能的分子机制，为将UBE2T作为鼻咽 癌的分子诊断、预后判断标记及分子靶向治疗靶标提供理论依据。 本研究拟采用免疫组化技术(IHC)检测UBE2T在149例鼻咽癌样本中的 表达，分析UBE2T表达同鼻咽癌患者恶性特征及不良预后问的相关性，并进一 步通过表达和(或)干扰UBE2T基因表达、western blot及免疫荧光 (immunoflurescence，IF)等技术探讨UBE2T对鼻咽癌细胞体内外增殖及转移 的影响和可能的机制。 方法 1、UBE2T在鼻咽癌患者组织样本中的表达 利用免疫组织化学技术(Immunohistochemical staining，IHC)检测149例 鼻咽癌患者石蜡组织样本中UBE2T的表达水平，并进行IRS(immunoreactive score，IRS)评分，明确UBE2T在鼻咽癌及相应癌旁组织中的表达水平；根据 评分高低，采用Spearman相关分析评价UBE2T表达与鼻咽癌各临床特征参数 之间的相关性；并应用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验探讨UBE2T表 达水平对鼻咽癌患者预后的影响；运用单因素及多因素COX比例风险回归模型 评价各临床特征参数及UBE2T表达水平对鼻咽癌患者预后的影响(单因素分析 有意义者(尸0．05)被纳入多因素分析)，明确UBE2T是否是鼻咽预后判断的 独立风险因子。 2、探讨UBE2T体内外促鼻咽癌细胞增殖及转移效应 2．1 UBE2T体内、外促鼻咽癌增殖作用 通过western blot检测UBE2T在多株鼻咽癌细胞株中的表达，筛选出UBE2T 相对低表达株C666．1及相对高表达株CNE2，进行相应的过表达及干扰试验。 用过表达慢病毒载体Lv．UBE2T或小干扰RNA siUBE2T转染鼻咽癌细胞株，构 建UBE2T过表达C666—1细胞株或UBE2T沉默的CNE2细胞株，采用western blot 方法检测转染后UBE2T在各鼻咽癌细胞株中的表达水平，然后利用MTT法检 测慢病毒UBE2T过表达对鼻咽癌细胞株C666—1，及CCK8法检测UBE2T siRNA III 万方数据 摘要 摘要 干扰对鼻咽癌细胞株CNE2体外增殖的影响。通过平板克隆试验检测慢病毒 UBE2T过表达对C666．1鼻咽癌细胞株体外克隆形成能力的影响。为检测UBE2T 过表达对鼻咽癌细胞体外增殖的影响，共转染荧光素酶慢病毒及LV-UBE2T慢 病毒构建荧光追踪的UBE2T过表达C666．1鼻咽癌细胞株；为检测UBE2T干扰 对鼻咽癌细胞株CNE2体内增殖的影响，UBE2T干扰慢病毒载体LV-sh UBE2T 转染构建UBE2T沉默的CNE2鼻咽癌细胞株。分别于BALB／c裸鼠双侧背部皮 下注射UBE2T过表达及对照C666．1鼻咽癌细胞株，和UBE2T干扰及对照CNE2 鼻咽癌细胞株构建裸鼠皮下瘤模型，采用活体成像技术、瘤体称重和Ki．67免疫 组化染色等技术检测UBE2T过表达对C666．1鼻咽癌细胞株和UBE2T干扰对 CNE2鼻咽癌细胞株体外增殖能力的影响。 2．2 UBE2T体、内外促鼻咽癌细胞迁移、侵袭及转移作用 在建立LV-UBE2T过表达或siUBE2T干扰的鼻咽癌细胞株的基础上，通过 划痕试验检测UBE2T过表达对鼻咽癌细胞株C666—1体外迁移能力的影响，以 及UBE2T干扰对鼻咽癌细胞株CNE2体外迁移能力的影响；通过基质胶 Transwell检测UBE2T过表达对C666．1鼻咽癌细胞株以及UBE2T干扰对CNE2 鼻咽癌细胞株体外侵袭能力的影响。将LV-UBE2T及荧光素酶慢病毒共转染的 C666．1鼻咽癌细胞株BALB／c裸鼠鼠尾静脉注射，通过活体成像、HE染色技术 检测UBE2T过表达对鼻咽癌细胞株C666．1体内转移能力的影响。 3、UBE2T促进鼻咽癌细胞株增殖、侵袭及转移的机制 利用western blot技术检测UBE2T慢病毒过表达对C666．1及siRNA干扰对 CNE2鼻咽癌细胞株促增殖及转移相关蛋白标记(Cyclin D1、C．JUN、C．MYC、 MMP2、MMP9)和AKT／GSK313／13一catenin信号通路蛋白(p-AKT、p-GSK3IB、 IB-catenin)表达的影响；利用免疫荧光技术和核浆蛋白分离western blot技术检 测UBE2T对C666．1鼻咽癌细胞株IB-catenin核浆转位的影响。通过普通Transwell 及基质胶Transwell检测AKT