多瘤病毒jcv的流行状况及其感染与肝病相关性研究临床检验诊断学专业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文多瘤病毒JCV的流行状况及其感染与肝病相关性研究 温州医学院硕士学位论文 多瘤病毒JCV的流行状况及其感染与肝病相关性研究 中文摘要 目的 通过确立JCV DNA与抗JCV抗体检测技术，筛查我国正常人群与肝病人 群标本，以了解JCV的流行状况及其感染与肝病的相关性，为JCV的预防与控 制提供重要的科学依据。 方法 1．确立JCV DNA检测技术与JCV全长基因扩增技术 用试剂盒提取标本总DNA，通过常规PCR法与半巢氏PCR法检测标本JCV DNA，以琼脂糖凝胶电泳与测序技术比较两种PCR方法的灵敏性与特异性，确 立合适的JCV DNA检测技术。 使用高保真性的DNA聚合酶，通过常规PCR法，确立JCV全长基因扩增 技术。 2．制备JCV病毒样颗粒并确立抗JCV抗体检测技术 利用基因合成技术合成JCV标准株Mad．1 VPl序列，通过基因工程手段， 构建PET-JCVPl表达质粒。将PET-JCVPl质粒转化BL21(DE3)与Transetta(DE3) 大肠杆菌，IPTG诱导，SDS．PAGE分析检测表达产物，以确立最佳表达宿主菌。 通过大量表达JCVP 1蛋白，以非连续蔗糖密度梯度超速离心法、非连续CsCI密 度梯度超速离心法与氯仿抽提．PEG沉淀法纯化JCV病毒样颗粒，通过SDS． PAGE与透射电子显微镜观察，比较三种纯化方法的纯化效果，确立最佳的JCV 病毒样颗粒纯化方法。 以原核系统表达且已纯化的JCV病毒样颗粒为抗原，建立检测血清的抗JCV 抗体IgG的酶联免疫吸附试验法(ELISA法)。 3．用确立的JCV DNA与抗JCV抗体检测技术筛查正常人群与肝病人群标本 通过确立的JCV DNA与抗JCV抗体检测技术，筛查正常人群与肝病人群的 标本，通过数据分析，统计JCV DNA与抗JCV抗体的流行率、年龄与性别分布 特点。通过卡方检验，对肝病人群的JCV DNA与HBV DNA进行统计分析，研 究JCV与肝病的相关性。 结果 1．确立JCV DNA检测技术与JCV全长基因扩增技术 使用常规PCR法与半巢氏PCR法扩增标本JCV DNA，比较两种方法的特 温州医学院硕士学位论文异性与灵敏性、便捷性等，最终确立常规PCR法为检测JCV 温州医学院硕士学位论文 异性与灵敏性、便捷性等，最终确立常规PCR法为检测JCV DNA的合适方法。 通过常规PCR法建立JCV全长基因的扩增技术，并获得一株JCV全长基因。 对该株JCV全长基因进行分析，并绘制了JCV全长基因结构图。 2．制备JCV病毒样颗粒并确立抗JCV抗体检测技术 通过基因工程手段成功构建PET-JCVPl表达质粒。使用BL21(DE3)与 Transetta(DE3)大肠杆菌小量表达JCVPl蛋白，结果显示BL21(DE3)不表达VPl 蛋白，而Transetta(DE3)的VPl蛋白表达量约占30％菌体总蛋白，因此确立 Transetta(DE3)为最佳表达宿主菌。通过大量表达JCVPl蛋白，以非连续蔗糖密 度梯度超速离心法、非连续CsCl密度梯度超速离心法与氯仿抽提．PEG沉淀法纯 化JCV病毒样颗粒，通过SDS．PAGE与透射电子显微镜观察，比较三种纯化方 法的纯化效果，确立氯仿抽提．PEG沉淀为最佳的JCV病毒样颗粒纯化方法。 以原核系统表达并且纯化的JCV病毒样颗粒为抗原，建立了检测血清的抗 JCV抗体IgG的ELISA法。 3．用确立的JCV DNA与抗JCV抗体检测技术筛查正常人群与肝病人群标本 用确立的PCR法与的ELISA法筛查了正常人群(299例)与肝病人群(88 例)的尿液、全血JCV DNA及血清抗JCV抗体。结果显示JCV在我国正常人 群与肝病人群中普遍流行，其中正常人群JCV DNA阳性率为52．5％、抗JCV抗 体阳性率为52．2％，肝病人群JCV DNA阳性率为47．7％、抗JCV抗体阳性率为 38．6％。此外，正常人群与肝病人群JCV DNA均随年龄上升而上升。通过对JCV DNA与HBVDNA进行卡方检验，发现无显著差异，说明JCV感染与HBV感 染导致的肝病无相关性。通过对随机挑选的12株JCV DNA PCR产物进行基因 型分析，发现中国东部地区JCV流行株主要是7型。 结论 本文确立了JCV DNA与抗JCV抗体检测技术，对我国正常人群与肝病人群 JCV流行状况进行了初步研究，结果显示JCV在我国正常人群与肝病人群中普 遍流行。同时研究了JCV感染与肝病的相关性，发现JCV感染与肝病无相关性。 此外，发现中国东部地区JCV流行株主要是7型。 关键词 JC多瘤病毒；病毒样颗粒；PCR；ELISA；流行病 温州医学院硕士学位论文Epidemiology 温州医学院硕士学位论文 Epidemi