组织切片技术.ppt

2.5 包埋 将透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡块。 用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃。  操作过程：  包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。 1.切面向下，每个蜡块可以包2-4个组织，每个纸盒可以包多个蜡块。 2.先将热包埋蜡（可以加适当比例蜂蜡）倒入纸盒内，用小镊子摆好组织块，全过程有电热吹风机吹热分，以保证蜡处于融化态。 3.包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其凝固。 4.待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆开纸盒，取出蜡块。 。 注意： ①包埋时夹取组织的镊子，用酒精灯随时烧热，以免石蜡凝结后粘附在镊子上，造成蜡块凝固不均匀。 ②包埋操作要迅速，组织从浸蜡杯中取出置入包埋框中的时间应尽量缩短。 ③包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状，一般出现在组织周围或组织的底部，应考虑这样几个方面的问题：a. 脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了，组织进行包埋时，包埋框中的蜡已成凝结状。c.组织内还残留有较多的透明剂，d.石蜡不纯。 ④包埋箱中的温度必须保持恒定。 ⑤如包埋得不好，可将蜡块溶化，重新浸蜡和包埋。 常规石蜡包埋过程 (1)固定：10%福尔马林24h～48h，流水冲洗 (2)脱水：75％、85％乙醇，95％乙醇Ⅰ、Ⅱ，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。 (3)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ (4)浸蜡：二甲苯/石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ (5)石蜡包埋：修蜡块，标号 （一）石蜡切片前的准备 1．切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。 2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。 3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。 4．载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（蛋白甘油、APES或多聚赖氨酸），根据染色方法选择不同的粘附剂。 5．准备好毛笔、镊子、染色架。 6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。 修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。修成正方形、长方形或梯形，受刀面一定要平行，组织周围留约2 mm的石蜡边 固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。有时要将蜡块牢固地粘到小木块上，注意切面和受刀面平直。如果气温高粘好块后，可以放在4℃冰箱里，先预冷。 2.6 切片 切片： 刀要锋利，刀口要与切面（约25度角）和受刀面平行。先20-50微米的粗切修面，然后调到5微米。为连成带状，需要哈气，增加水汽表面张力，使切片展开。毛笔转入干净硬纸上。一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。 贴片 展片和捞片： （1）直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片铺在小滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。 （2）温水漂浮法：此法用展片机或者用恒温水浴箱，先使水温保持在45~50℃，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置于展片器的水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然后捞片，并及时编号。先用拨针将蜡片分开，光面贴水，在水浴中展开后拨去多余的蜡。 用载玻片（注意标记和记录）捞取组织，并调节到最佳位置。一张载波片上可以放1-3块蜡片 展好的切片在室温下稍微干燥后，放在40℃恒温烤箱中，小片组织30分钟即可，大的需12~24小时，烤干备用 切片: 用切片机将组织切成5~10μm厚的蜡片，然后将其放到温水上，待其完全展开后，裱到有粘附剂的载玻片上。 切片前的准备工作（附录） (1)载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂粘合剂。如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。 附录1.载玻片和盖玻片清洗方