冷冻扫描电镜技术应用刘扬关波.PDFVIP

冷冻扫描电镜技术的应用 刘扬 关波 （分析测试中心电镜组TEl ：010Email ：guanbo@iccas.ac.cn ） ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1. 冷冻扫描电镜概述 常规扫描电镜要求所观察的样品无水，而一些样品在干燥过程中会发生结构 变化，致使无法观察其真实结构。冷冻扫描电镜技术能够对含水(溶剂)样品进行 成像和分析，实现对于液态样品(如乳液、囊泡等)及不耐电子束损伤样品的微观 形貌的观察。在冷冻扫描电镜观察前，液态样品经过低温冷冻固定、断裂、镀膜 （喷金/ 喷碳）等制样处理后，再通过冷冻传输系统将其置于电镜内的冷台（温 度可至-185℃）即可进行观察。其中，快速冷冻技术可使水在低温状态下呈玻璃 态，减少冰晶的产生，从而不影响样品本身结构，冷冻传输系统保证样品传输过 程中保持低温状态，整个系统从制样到观察都在低温下进行，尽可能保持样品在 液相中的原位结构。 2. 系统组成及流程 冷冻扫描电镜系统包括冷冻固定、冷冻断裂、升华及导电性喷涂等制样设备， 冷冻传输装置及扫描电镜的冷台，样品首先经过高压冷冻或液氮泥方法进行冷冻 固定，然后在冷冻条件下传输到真空溅射仪中进行断裂，露出样品新鲜的断裂面， 并根据样品情况进行升华防止表面被冰包覆，之后进行导电性喷涂，至此制样完 成，通过冷冻传输系统将样品置于扫描电镜的冷台进行观察。分析测试中心电镜 组现有的冷冻扫描电镜系统包括高压冷冻仪Leica EM HPM100 、冷冻传输样品 杆Leica EM VCT100 、离子溅射仪Leica EM ACE600 、自制的液氮泥冷冻装置、 冷冻扫描电镜用的冷台。 冷冻固定 真空冷冻传输 冷冻断裂/喷涂 真空冷冻传输 Cryo - SEM 高压冷冻仪 Leica EM HPM100Leica 冷冻传输样品杆 离子溅射仪 冷冻扫描电镜冷台 液氮泥冷冻装置 Leica EM VCT100 Leica EM ACE600 Nitrogen slush freezer 2.1 冷冻固定 2.1.1 高压冷冻固定 冷冻固定的目标是在低温下使液态样品中的水不结晶而呈玻璃态，这样既能 将样品在液相的状态固定，又避免了水结晶引起样品结构的破坏。因此，冷冻固 定的关键是要阻止冰晶形成，冷冻固定是否成功，取决于冷冻过程迅速通过一个 温度范围，即水开始结晶的温度到开始重结晶的温度区间，此区间受环境压力、 样品浓度等因素的影响。如图1[1]所示，第一行是常压下的纯水，从273 K 开始 结晶，因考虑到过冷水的作用，所以从 231 K 开始结晶，当温度低于重结晶温 度 136 K 时，结晶过程停止。第二行是常压下的样品，通常样品包含溶质会降 低样品的熔点（与溶质浓度有关系），同时提高重结晶温度，使得结晶的温度区 间减小。第三行是施加 204.5 MPa 压力的样品，可以看出，施加高压会进一步 降低样品的熔点且提高重结晶的，所以结晶的温度区间进一步减小。 因此，可用高压冷冻的方式将液态样品进行快速冷冻固定，具体如图2[1]所 示，在10ms 内，压力由常压瞬间升高至约200 MPa ，同时用液氮使样品温度迅 速下降，当通过水的结晶区间，直到温度低于约 136 K 后，即形成玻璃态的水。 对于 200 µm [3]厚的样品，样品中心区域通过这一温度区间大约需要 30 ms 。 图1.冷冻固定时，溶质浓度和压力对水结晶温度区间的影响示意图 图2.高压冷冻仪冷冻曲线 具体操作流程如下，用移液枪将待测样品滴入冷冻样品夹片的下片，下片中 有凹槽，可储存一定量的液体样品，然后盖上夹片上片，组成一个三明治结构， 上下两片的材质均为铜镀金，之后将载有样品的整个夹片置于绿色的固定片上， 推入高压冷冻仪中即可进行高压冷冻固定（图3 ），每次进行一次高压冷冻，仪 器会生成一条冷冻曲线，根据曲线中达到目标压力和温度的时间可初步判断冷冻 固定的效果。