三邻甲苯磷酸酯染毒母鸡神经你组织中自噬相关蛋白的表达及其磷酸化的变化-劳动卫生与环境卫生学专业毕业论文.docx

CONTENTSAbstract CONTENTS Abstract in Chinese．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1 Abstract in English．．．． ． ．．．．．．． ． 4 Symbolic description．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8 Introduction．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1() Materials and Methods ．． ．．． ．．．．．．．． ．．．．． ．．．．．1 8 Results．．．．．．．．．．． ．．． ．．．．．．． ．．． ．．．．．．．．．．．．27 Discussion．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．34 Conclusion．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．44 Reference．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．45 Acknowledgement．．．． ．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．52 Publications．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．53 万方数据 三邻甲苯磷酸酯染毒母鸡神经组织中自噬相关蛋白的表达 三邻甲苯磷酸酯染毒母鸡神经组织中自噬相关蛋白的表达 及其磷酸化的变化 研究生：童彦菊 导师：宋福永副教授 摘要 研究目的 有机磷化合物(organophosphorus compounds，OPs)是指含有有机基团的磷 酸衍生物，在农药、阻燃剂、增塑剂以及战争毒剂等方面应用比较广泛。除可引 起接触者发生急性毒性中毒外，部分有机磷化合物还能导致人类和一些敏感动物 发生一种不可逆的迟发性神经病(organophosphate—induced delayed neuropathy， OPIDN)，其发病机制目前尚不清楚。自噬是细胞维持自身稳态的重要机制，近 年研究发现自噬与多种神经退行性疾病有关，而OPIDN的病理改变也属于神经退 行性病变，因此我们推钡UOPIDN的发生可能也与神经元自噬异常有关。 本研究我们通过建立两个动物模型：三邻甲苯磷酸酯(Tri—ortho．cresyl phosphate，TOCP)诱导的OPIDN动物模型以及OPIDN 预动物模型，通过 Western—blot实验方法检测母鸡神经组织中自噬相关蛋白及其磷酸化水平的变 化，探讨自噬在OPIDN发生中的作用，研究OPIDN发生的分子机制。 研究方法 1、TOCP诱导OPIDN动物模型和OPIDN干预动物模型的建立 选取成年罗曼母鸡60只，适应性饲养3天，其中30只动物用于OPIDN动 物模型的建立，即将动物随机分成5组，分别为对照组、ld、5d、10d、21d组， 每组6只，将TOCP充分溶解于玉米油中，一次性灌胃进行TOCP染毒，染毒剂 量为750mg／kg，同时给予对照组等体积的玉米油，在TOCP染毒后上述相应时 间点断头处死动物，在冰袋上快速取出脊髓和胫神经置于液氮中，．80。C保存备 用。将另外30只动物用于OPIDN干预动物模型的建立，将动物随机分为6组， 分别为对照组、0d、1d、5d、10d、21d组，每组5只，提前24h皮下注射90mg／kg 的PMSF后，再染毒剂量为750mg／kg的TOCP，同时也给予对照组等体积的玉 米油，在TOCP染毒后上述相应时间点断头处死动物，在冰袋上快速取出脊髓和 万方数据 胫神经置于液氮中，．80。C保存备用。在模型制备过程中，每天观察记录动物的 胫神经置于液氮中，．80。C保存备用。在模型制备过程中，每天观察记录动物的 OPIDN症状，并按8级评分标准评价母鸡OPIDN的进展。 2、脊髓和胫神经组织中自噬相关蛋白含量的测定 取适量脊髓和胫神经组织(脊髓切成小段，胫神经在液氮中碾成粉末)，分 别按照质量体积比为l：5的比例加入预冷的匀浆缓冲液，在冰水浴中进行匀浆， 然后在冰上静置30min，14000r／min、4C离心30min，取上清、弃沉淀，利用 BCATM protein Assay Kit对上清中的总蛋白含量进行定量。Western．blot分别检 测脊髓和胫神经组织中自噬相关蛋白Beclinl、p-Beclinl