重组蛋白药物克隆表达.pptVIP

对目的基因进行REAL-TIMEPCR定量分析 实验结果图 对目的基因进行REAL-TIMEPCR定量分析 设内参基因Ct值为10，对照基因Ct值为12 对目的基因进行real-time PCR定量分析 实验结果： 谢谢欣赏 重组蛋白药物克隆表达 PCR ??????????????PCR?聚合酶链反应（polymerase?chain?reaction,?PCR）是指由一对引物介导的基因或克隆的特定DNA序列的酶促扩增的反应过程，即在一对人工合成的特异性引物介导下，以目的DNA为模板，使用耐热DNA聚合酶，经变性、退火及延伸三个步骤的多次循环，扩增特定DNA片段的过程（其本质是DNA复制）。 PCR的创建 Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。” 但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径，所以，Khorana的设想被人们遗忘了。 1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。 PCR的创建 1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。 1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片段； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。 学习任务 基因扩增 PBV220-rlFN为模板扩增r-lFN基因 RNA为模板两步法扩增目的基因 对目的基因进行real-time PCR定量分析 原理：利用模板变性，引物退火和引物延伸多个循环来扩增DNA序列。 注：不同的物质会存在预变性和延伸，这两个前缀和后续。 药品：DNA液25微升、RNA液20微升、 仪器：PCR电泳仪、若干小离心管 PBV220-RIFN为模板的扩增（PCR） 反应体系: ddH2O 15.75 μL 10×PCR Buffer 2.5 μL dNTPs(10 mmol/μL) 2 μL F-Primer（10 μmol/L） 1 μL R-Primer（10 μmol/L） 1 μL 质粒DNA(10 ng) 2.5 μ L Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL 总体积25 μL 在4℃离心管平板下，往小离心管里加入8微升的水，4微升的buffer，Oligo1微升，dNTP1微升，RI1微升，MMLV1微升，用10微升的枪头进行混合，吹打，离心几秒即可，放进PCR仪中（设置各个参数，98℃、30S，60℃、30S，72℃、30S，反复进行30次）操作后，去2微升模板到新的小离心管中，加入MIX混合12.5微升，上、下引物各1微升，水8.5微升，再次PCR操作，参数同上。 进行跑电泳，观察DNA条带是否清晰 PBV220-RIFN为模板的扩增（PCR） 实验结果 以RNA为模板两步法扩增目的基因（RT-PCR） 反应体系: RNA cDNA ddH2O 8μL Buffer 4 μL RNA 4uL Oligo dT 1uL dNTPs 1 μL RI