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流式细胞仪的应用 主讲人：王银 流式细胞术在基础研究中的应用 细胞活力的检测 细胞周期分析 细胞凋亡分析 多药耐药基因研究（MDR） RNA测定、DNA测定 细胞内离子的测定及pH值测定 流式细胞术的临床应用 白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验 guava easyCyte? 8HT 微毛细管细胞分析仪 厂家：Millipore获奖理由：突破性的微毛细管技术，无需鞘液，样品体积少，废液更少，让细胞分析变得更简单、快捷、易于操控 细胞活力的检测 细胞周期分析 在细胞周期内DNA含量各时期发生周期性变化，通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定，可分析细胞周期各时期相对的百分比，了解细胞群体的倍体性和增殖能力。 DNA含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。 恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，DNA含量分析对肿瘤的诊断预后有很高的价值,尤其对细胞毒性药物的研究很有价值。 样品制备 经RNA酶处理前后的比较 结果解读 G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76 G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43 S期占25.73 G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2） 峰的变异系数为4.54%（好） 细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。 总的细胞数（仪器检测到的）为17525个， 在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后） CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。 应用DNA含量测定鉴定细胞凋亡 如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期) 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。 流式细胞术在生殖医学中的应用 细胞凋亡分析 细胞凋亡 特点：染色质的浓缩, 核膜及细胞膜的内陷, 接着核碎裂成分离的片段,凋亡小体(apoptosis body)的出现。 在流式细胞仪上，对于光散射特性观察凋亡细胞的改变：由于细胞的固缩，体积变小，FSC会变小，而细胞碎片及颗粒增多，SSC也会改变。 caspase-3 Annexin-V-FITC/PI双染法 正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含有带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，PS），而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。 在细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的PS迁移到细胞外层表面。Annexin V是一种对Ca2+依赖，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。 Annexin V Assay Annexin-V-FITC/PI双染法 由于坏死细胞也可能在细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸，又在细胞凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期。细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。 在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V+/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-。 Annexin V Assay区分死亡与凋亡 Annexin V-PI Analysis 实验步骤 1.离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。 2.?用冷PBS洗涤细胞两次。 3.用400ul 1X Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1 X 106 cells/ml。 4.在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。 5.加入10ul PI后轻轻混匀，于2-8°C避光条件下孵育5分钟。 6.?在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。 原 理 细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，根据细胞凋亡和坏死的形态特点，一般认为在细胞坏死早期就会出现细胞膜通透性及线粒体跨膜电位的改变，而在细胞凋亡时这些改变的发生则要晚。一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 凯基细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（JC-1 Apoptosis Detection Kit） 采用一种阳离子脂质荧光染料JC-1作为检测