环境微生物学第八九章实验报告.docx

一、目的要求 1、了解纤维素分解的基本知识。 2、掌握观察纤维素好氧和厌氧分解的一些基本实验技术。 3、认识氨化细菌，并掌握用纳氏试剂和石蕊试纸测定氨化作用的方法。 4、认识硝化作用和反硝化作用，掌握观察硝化作用和反硝化作用的实验方法。 5、学习观察活性污泥（或生物膜）及其生物相的方法。 　 6、初步掌握根据活性污泥（或生物膜）及其生物相，推断污水生物处理系统工作状态的技能。 二、基本原理 纤维素由β-葡萄糖聚合而成，性质非常稳定。纤维素是光合作用的产物，约占植物组织的50%左右。在自然界，每年都有大量纤维素随植物残体或有机肥料进入土壤。在通气良好的土壤中，纤维素可被细菌、放线菌和霉菌分解，先形成纤维二糖、葡萄糖等中间产物，再彻底分解成CO2和水。细菌中噬纤维菌科和堆囊粘菌科的一些属具有较强的纤维素分解能力。在实验室中，经常以纤维滤纸为基质，通过液体培养或固体培养来测定好氧微生物对纤维素的降解能力。 在厌氧条件下，分解纤维素的微生物主要是梭菌，如产纤维二糖芽孢梭菌和嗜热纤维芽孢梭菌，产物是有机酸、醇类以及甲烷和CO2等。在实验室中，一般采用液体培养基来测定厌氧微生物对纤维素的降解。若滤纸条被分解后发生断裂或失去原有物理性状，便判定该厌氧微生物具有分解纤维素的能力。 蛋白质是复杂的含氮有机物，在生物体中普遍存在。它可以被许多微生物（包括细菌、放线菌和真菌）分解而产生氨，称为氨化作用。在不含无机氮的牛肉膏蛋白胨培养基上，所生长的细菌大多是氨化细菌。氨化细菌分解蛋白质释放氨，可用石蕊试纸和纳氏试剂检测。石蕊试纸遇氨显蓝色，纳氏试剂与氨反应显棕褐色。 氨氧化成硝酸的过程，称为硝化作用。它由两类细菌分两个阶段进行，氨氧化为亚硝酸的反应由亚硝化细菌引发，而亚硝酸氧化为硝酸的反应则由硝化细菌所致。亚硝酸与格利斯试剂生成绛红色化合物，硝酸与二苯胺试剂生成蓝色化合物，因此用格利斯试剂和二苯胺试剂可以监测硝化过程。 在无氧条件下，硝酸盐可以被许多微生物还原成氮气，称为反硝化作用。大多数反硝化菌是异养型微生物，能够以有机物为电子供体，将硝酸或亚硝酸逐步还原成氮气。用格利斯试剂和二苯胺试剂可以监测反硝化过程。 活性污泥（或生物膜）是污水生物处理系统的主体，污泥的数量、活性和沉降性直接与生物处理系统的工作效能密切相关。污泥（或生物膜）中的生物相（种类、丰度、状态）是赋予污泥活性的关键因素。污泥（或生物膜）生物相较为复杂，以细菌和原生动物为主，也有真菌和后生动物等。当水质条件或曝气池操作条件发生变化时，生物相也会随之变化。一般认为，原生动物固着型纤毛虫占优势时，污水处理系统运转正常；后生动物轮虫大量出现则意味着污泥已经老化；缓慢游动或匍匐前进的生物出现时，说明污泥正在恢复正常状态；丝状菌占据优势，甚至伸出絮体外，则是污泥膨胀的象征。发育良好的污泥具有一定的形状，结构稠密，沉降性能好。因此，观察活性污泥絮体及其生物相，可初步判断生物处理系统的运转状况，有助于及时采取调控措施，保证生物处理系统稳定运行。 三、实验器材 1、样品：菜园土，水稻土,阴沟污泥, 取自城市污水处理厂的活性污泥。 2、培养基：纤维素好氧分解固体培养基;纤维素厌氧分解菌培养基（配制方法见附录）;牛肉膏蛋白胨培养基，分装至1.5×15cm试管中，每管5mL，0.1MPa，灭菌30min;硝化培养基（配制方法见附录），分装至100mL三角瓶，每瓶装30mL，0.1MPa灭菌30min;反硝化培养基（配制方法见附录），分装至1.5×15cm试管中，每管10mL，加一杜氏小管，0.1MPa，灭菌30min。 3、染色液：石炭酸复红染色液，纳氏试剂，格利斯试剂 ，浓硫酸，二苯胺试剂。 4、仪器及相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸。 5、其它用品：载玻片，盖玻片，吸水纸，酒精灯，接种环，镊子，无菌培养皿，直径9cm的无菌滤纸，尼龙纸，橡皮圈,药匙，白色比色蝶，滴管，石蕊试纸（红色）等。 四、实验程序 （一）纤维素的好氧分解 1、制作平板：取已融化的纤维素好氧培养基（每组做一皿），倒入无菌培养皿中，制成平板。 2、放置滤纸：用镊子取无菌滤纸1张，放入已凝固的琼脂平板上，紧贴，使滤纸表面湿润。 3、加放土粒：用镊子取肥沃菜园土10余粒，均匀排在滤纸表面，进行接种。 4、恒温培养：放入培养箱，28～30℃条件下培养7～10d。 5、结果检查：先观察土粒周围有无黄色、桔黄色、棕色等色斑出现。土粒周围滤纸有无破碎变薄现象。用解剖针从带有色斑处挑取少许滤纸至载玻片上，涂片，固定，染色，在油镜下观察并绘图。 （二）、纤维素的厌氧分解 1、接种：以接种匙取水稻土少量，接种在装有滤纸条纤维素深层培养液中，套上试管套，再用尼龙纸和橡皮筋将管口扎紧。 2、培养：放在35～37℃条件下培养10～15d。