根肿病菌侵染茎瘤芥差减文库的构建及其差异表达基因鉴定-植物学专业论文.docx

中文摘要 中文摘要 重庆大学博士学位论文 重庆大学博士学位论文 I I PAGE PAGE VI 摘 要 茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen）, 是重庆市涪陵区的特色农业资源， 其收获物瘤茎（俗称青菜头）是世界三大名腌菜之一“涪陵榨菜”的主要原料。茎瘤 芥营养丰富，加工后形成的榨菜脆嫩爽口、味道独特，深受国内外消费者的喜爱。 榨菜业的发展为涪陵地区带来了稳定的经济效益和社会效益。可近年来，由于十 字花科根肿病的扩展蔓延，严重影响茎瘤芥的产量，造成巨大的经济损失。根肿 病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）侵染所致。鉴于根肿病菌是一种单 科单属的活体专性寄生真菌，不能进行体外人工培养，病原菌全基因组未测序， 已知功能基因甚少，与其他病原菌的同源性不高，加之抗性材料缺乏，给抗病育 种带来较大的影响。培育抗病品种是防治根肿病最有效的途径，抗性品种的选育， 需要探明根肿病菌和茎瘤芥之间的分子互作关系，阐明根肿病的致病机理。 因此，本论文从芸苔根肿菌和宿主茎瘤芥之间的分子互作入手，发掘茎瘤芥 受根肿菌侵染后差异表达基因并研究其潜在的功能，将为阐明根肿病的致病机理、 获得抗病相关基因，为病害的防治奠定基础。本研究通过几年研究工作，取得了 以下主要成果。 1）成功构建茎瘤芥抑制差减杂交文库：基于建立的稳定重复利用的茎瘤芥苗 无土快繁种植体系，即采用珍珠岩加MS营养液，在光照培养箱中大量培育茎瘤芥 幼苗。茎瘤芥苗两周达到出四叶期，为芸苔根肿菌的致病性接种及病原菌和寄主 植物的互作提供了充足试验材料。利用抑制差减杂交文库技术，以人工接种感染 芸苔根肿菌的感病植株和健康植株分别作为实验组和驱动组成功构建抑制差减杂 交文库。经蓝白斑筛选，菌落PCR验证和斑点杂交，获得224个阳性克隆子。将阳 性克隆子测序，得到高质量的EST序列196条，平均长度为332bp。将聚类、拼接的 173条EST序列和NCBI的NT、EST数据库进行比对，其中146条 (84.4%) EST序列 和植物已知序列具有同源性。将聚类、拼接的173条EST序列所编码的蛋白质与 NCBI的NR数据库进行比对，其中58条EST序列（33.5%）所编码的蛋白质和已知 蛋白基因具有相似性，15条EST序列（8.7%）和假想蛋白基因具有相似性，100条 EST序列 （57.8%）与已知蛋白的基因没有同源性。利用在线软件对编码的蛋白质 功能进行生物信息学分析显示，这些基因编码的蛋白质参与了多种细胞结构和分 子过程，如能量代谢(11.11%)、压力反应和防御(5.56%)、运输(5.56%)、转录调控 (5.56%)、翻译和生物合成（33.33%）及其他功能(38.91%)。EST序列在线提交NCBI 的dbEST数据库，登录号是JK615948-JK616120。 2）茎瘤芥 SSH 文库重要差异基因的筛选验证：采用实时荧光定量 PCR 分析 了正向差减文库中随机挑取的四个基因的在不同时间表达水平。生物信息学分析 表明这四个基因 JK616040，JK616031， JK615948 和 JK615982 分别是 ATP 合成 酶链基因，40S 核糖体蛋白基因，细胞色素 b5 氧化还原酶基因和热休克转录因子 基因。同茎瘤芥健康植株相比，四个基因在罹病植株中均呈现明显的上调表达， 证实本文所构建茎瘤芥 SSH 差减文库可信度高，从中筛选差异表达 EST 序列准确 可靠。 3）茎瘤芥重要差异基因的动态表达分析：对文库中的重要 EST 序列进行生物 信息学分析，筛选出与植物防御或者感病响应相关的 6 类蛋白或受体的编码基因。 与健株相比，病株中的乙烯反应转录因子（JK616020）在接种后 10 天到 15 天表 达下调，而在接种 20 天以后，病株中的表达量几乎都大于健株。脱落酸受体 （JK616120）基因在接种 25 天以前在病株中的表达量相对健株降低，而在接种后 30 天和 40 天在病株中的表达量远远大于健株。钙依赖蛋白激酶基因（JK616046） 在病株中的转录水平与健株相比，从接种后 10 天到 25 天表达上调，而在接种 30 天和 40 天时表达降低。醌还原酶家族蛋白（JK616070）基因在接种后 15 天到 30 天，相对健株，在病株中的表达量均降低，只在接种后 40 天在病株中的表达量大 于健株。热休克转录因子(JK616021) 和 JK616047（MYB 家族转录因子）的转录量 在接种后 15 天以前, 在病、健组织中无显著区别，在接种 15 天以后病株表达量均 大于健株。病程相关蛋白基因 PR4（JK616077）在病株中的表达量均大于健株， 在接种后 40 天，在病株的表达量显著增高。