复杂微生物群落物种特异性引物的设计方法研究-海洋科学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 Classified Index: Q789 U.D.C: 577 Dissertation for the Master Degree in Science DESIGN OF THE SPECIES-SPECIFIC PRIMERS FOR NATURAL COMPLEX MICROBIAL COMMUNITY Candidate： Li Kaiqiang Supervisor： Prof. Zhang zhizhou Academic Degree Applied for： Master of Science Speciality： Marine Science Affiliation： School of Marine Science and Technolog y Date of Defence： June, 2014 Degree-Conferring-Institution： Harbin Institute of Technology 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 哈尔滨工业大学理学硕士学位论文 摘 要 微 生 物 群 落 结 构 的 研 究 一 直 是 微 生 物 生 态 学 和 环 境 科 学 研 究 的 热 点 内 容，除了依靠传统的微生物培养方法外，经常采用的一种研究手段是通过直 接提取群落中样品总的 DNA 或 RNA，利用荧光实时定量技术通过设计物种 特异性的引物来定量群落中不同物种的含量。在该研究手段中，特异性引物 的设计占有举足轻重的地位，如何设计更加特异的引物， 以及对设计的引物 进行合理的评估等，都是首先需要解决的问题。 本课题以古井贡酒中大曲和窖泥的微生物群落为研究对象，研究内容包 括两个方面： 首 先 根 据 自 行 设 计 的 特 异 性 算 法 开 发 一 款 搜 索 特 异 性 序 列 搜 索 的 软 件 Sequence-Analysis，用其对古井大曲和窖泥微生物群落物种的 16S rDNA 序列 进行计算，设计特异性引物，然后通过分子生物学试验验证引物的扩增情况。 其次尝试分别利用物种全基因组信息、物种特异性基因、以及非 16S 等 基因三种方案设计物种特异性引物，然后对引物扩增后凝胶电泳结果进行统 计分析，从引物扩增的成功率和引物特异性扩增的成功率两个方面来评估三 种引物设计方案的优劣。 本课题中，针对古井微生物群落以全基因组，特异性基因以及非 16S 等 基因三种方案为模板总共设计了 130 对引物，根据 PCR 扩增后凝胶电泳结果 统计利用全基因组，特异性基因以及非 16S 等基因设计引物的扩增成功率分 别为 36.14%，44.74%，33.33%，引物的特异性扩增成功率分别为 26.50%， 31.58%，33.33%。从结果上来看，利用特异性基因法设计的物种特异性引物 的成功率要明显的高于直接利用全基因组法设计的特异性引物。而在引物的 特异性扩增上，利用特异性基因法与非 16S 等基因法成功率基本持平，都要 高于直接利用全基因组设计的引物。 通过本课题的研究，在进行微生物群落特异性引物的设计时，我们建议 优先选择物种特异性基因进行设计，对于没有特异性基因的物种，选择全基 因组序列进行设计，对于特异性基因和全基因组序列都不存在的物种，如果 要研究其群落丰度的话，可以尝试通过查找其非 16S 等基因序列进行特异性 引物的设计。 关键词：引物设计；特异性基因；微生物群落；全基因组 I Abstract The study of microbial community structure has been a hot research content of microbial ecology and environmental science. In addition to the traditional microbiological culture methods, more research is to analyze the samples by direct extraction of total community DNA or RNA and quantify the levels of different species using the real-time fluorescence quantitative techniques or other molecular biology techniques. Specific primer design plays an important role in the process. How to design and evaluate the species-specific p