缝隙连接蛋白抗C乳x4腺3形成的GJIC对阿霉素体外癌作用的影响-药理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 2 缝隙连接蛋白Cx43形成的GJIC对阿霉素体外抗乳腺癌作用 的影响 研究生：蒋国君 指导老师：祝晓光 教授 童旭辉 副教授 中文摘要 目的： 1. 检测恶性程度不同的乳腺癌细胞（Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3） 中缝隙连接蛋白43（connexin43，Cx43）的表达。 2. 在乳腺癌细胞（Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3）中，分别用药理 学方法（GJ工具药）和分子生物学方法（siRNA）改变其GJ功能，观察对阿霉 素（adriamycin，ADM）抗肿瘤作用的影响。 方法： 1. 不同恶性程度乳腺癌细胞中Cx43表达及其形成GJ功能的检测 Western blotting检测上述乳腺癌细胞Cx43的表达水平。 免疫荧光法（Immunofluorescence Assay）检测上述乳腺癌细胞膜表面Cx43蛋 白表达。 1.3 细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）检测乳腺癌细胞间荧光传递功能，即 细胞GJ功能。 2 GJ功能改变后对阿霉素抗肿瘤作用的影响 2.1 MTT法检测不同浓度ADM（0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0μM）作用24 h、36 h 和48 h后，对四种乳腺癌细胞（Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3） 生长的抑制作用。 2.2 用不同密度接种细胞的方法，获得生长融合细胞（细胞之间有紧密接触，有条 件形成GJ）与生长未融合细胞（细胞之间无接触，无形成GJ的条件），在上 述不同密度接种的细胞，观察GJ形成对ADM的细胞毒性的影响。 2.3 GJ功能的调节： 2.3.1 工具药：GJ功能增强剂维甲酸（retinoic acid，RA）和GJ功能抑制剂油 酸酰胺（oleamide）、18-α-甘草次酸（18-α-glycyrrhetinic acid，18-α-GA）分 别调控乳腺癌细胞GJ功能后，检测对ADM抗肿瘤作用的影响； 2.3.2 分 子 生 物 学 方 法 ： 设 计 针 对 人 乳 腺 癌 细 胞 Cx43 的 siRNA 序列；用 Western blotting、“细胞免疫荧光法”和“细胞接种荧光示踪法”检测siRNA 对Cx43表达和GJ功能的抑制作用。用“MTT”法观察siRNA对ADM细胞毒性 的影响。 结果： 1. Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞中Cx43的表达 本实验采用Western blotting检测四种乳腺癌细胞中Cx43蛋白的表达，结果 显示： 恶 性 程 度 最 低 的 Hs578T 细胞 Cx43 表 达 水 平 最 高 ， 其 次 为 MCF-7 、 SK-BR-3，而恶性程度最高的MDA-MB-231细胞中Cx43蛋白表达水平最低。提 示，恶性程度较高的乳腺癌细胞Cx43蛋白表达水平反而较低。 2. Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞膜表面Cx43的表达 “细胞免疫荧光法”（Immunofluorescence）检测乳腺癌细胞膜Cx43的表达。 与Western blotting实验结果相似的是：恶性程度最低的Hs578T细胞膜表面Cx43 蛋白表达最高，其次为MCF-7、SK-BR-3，而恶性程度最高的MDA-MB-231细 胞膜表面Cx43蛋白表达最低。 3. ADM对四种乳腺癌细胞的生长抑制作用 MTT结果显示不同浓度的ADM均能抑制乳腺癌细胞生长，且随着ADM浓 度的增加和作用时间的延长，细胞的存活率降低，且24.0 μM ADM对四株乳腺 癌细胞的生长抑制作用最强。24.0 μM的ADM作用细胞24 h后，Hs578T、MCF-7、 MDA-MB-231和SK-BR-3细胞的生长抑制率分别为：25.38%、46.12%、43.41% 和31.35%。24.0 μM的ADM作用细胞36 h后，Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231 和SK-BR-3细胞的生长抑制率分别为：58.71%、48.87%、66.74%和53.47%。24.0 μM的ADM作用细胞48 h后，Hs578T、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3细胞 的生长抑制率分别为：72.48%、47.04%、97.97%和70.24%。因此我们可以看 出MDA-MB-231细胞对ADM最为敏感，而MCF-7对细胞随着时间的延长，敏 感性降低。 4. GJ功能增强剂对ADM抗肿瘤作用的影响 细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）实验结果表明，GJ 功能增强剂维 4 4 甲酸（ratinoic acid，RA）10 μM 预处理乳腺癌细胞 24 h，细胞荧光