缝隙连接蛋白Cx43形成的GJIC对奥沙利铂体外抗睾丸癌作用的影响-药理学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 2 缝隙连接蛋白 Cx43 形成的 GJIC 对奥沙利铂体外抗睾丸癌作用的 影响 研究生：韩溪 指导老师：陶亮 教授 童旭辉 副教授 中文摘要 目的： 1. 检测睾丸正常细胞（ TM3 、TM4 ）和睾丸肿瘤细胞（ I-10）中缝隙连接蛋白 43 （connexin43,Cx43）的表达。 2. 运用 GJ 工具药，改变 GJ 功能后，观察奥沙利铂（oxalipatin, OHP）细胞毒性的变 化。 3. 探讨缝隙连接功能与奥沙利铂抗肿瘤作用之间可能的机制。 方法： 1. 睾丸细胞中 Cx43 表达及其形成缝隙连接功能的检测 Western blotting 检测睾丸细胞 Cx43 的表达水平。 免疫荧光法（Immunofluorescence Assay）检测睾丸细胞膜表面 Cx43 蛋白的表达。 1.3 细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）检测睾丸细胞间的荧光传递功能，即细 胞 GJ 功能。 2． 调控 GJ 功能对奥沙利铂抗肿瘤作用的影响 2.1 MTT 法检测高低密度接种细胞条件下，(0、5.0、10.0、20.0、40.0 μM) oxaliplatin, OHP 作用睾丸细胞 24 h 后，睾丸细胞（TM3、I-10）的存活率。 2.2 用不同密度接种细胞（1×104-8×104cells/ml）的方法，获得生长融合细胞（细胞之 间紧密接触，有条件形成 GJ）与生长未融合细胞（细胞单个生长，无条件形成 GJ），随着密度的增加，生长融合程度增加，观察融合程度对(oxaliplatin,OHP)细 胞毒性的影响。 2.3 GJ 功能的调节： 工具药：GJ功能增强剂维甲酸（ retinoic acid, RA）和GJ功能抑制剂油酸酰胺 （oleamide）、18-α-甘草次酸（18-α-glycyrrhetinic acid，18-α-GA）分别调控睾丸细 胞GJ功能后，MTT法检测OHP对睾丸细胞增殖抑制的变化，Annexin V/PI双染方法， 检测OHP诱导的细胞早期凋亡的变化。 2.4 调控GJ功能后，Western blot检测，OHP诱导的凋亡蛋白Bcl-2、Bax 和抗增殖蛋白 Prohibitin的表达。 结果： 1. TM3、TM4、I-10细胞中Cx43的表达 本实验采用 western blotting 检测三种睾丸细胞中 Cx43 蛋白的表达，结果显示： 睾丸正常细胞 TM3、TM4 中 Cx43 表达水平相对较高，睾丸肿瘤细胞 I-10 中 Cx43 表达水平较低。提示，睾丸肿瘤细胞中 Cx43 蛋白表达降低。 2. TM3、TM4、I-10细胞膜表面Cx43的表达 细胞免疫荧光法（Immunofluorescence）检测睾丸细胞膜 Cx43 的表达。结果表 明：睾丸正常细胞 TM3、TM4 中 Cx43 表达水平相对较高，睾丸肿瘤细胞 I-10 中 Cx43 表达水平较低。 3. GJ 形成对 OHP 对 TM3、I-10 细胞增殖抑制的影响 MTT 结果显示 (0、5.0、10.0、20.0、40.0 μM) OHP 均能抑制睾丸细胞生长， 且随着 OHP 浓度的增加，细胞的存活率降低；在 TM3 细胞中，高密度接种细胞时 （生长融合，有 GJ 形成），OHP 对细胞增殖抑制作用低于低密度接种细胞（生长 未融合，无 GJ 形成）；在 I-10 细胞中，高密度接种细胞时（生长融合，有 GJ 形 成），OHP 对细胞增殖抑制作用高于低密度接种细胞（生长未融合，无 GJ 形成）。 4. 不同细胞生长密度对 OHP 对 TM3、I-10 细胞增殖抑制的影响 MTT 结果显示，在 1×104-8×104 cells/ml 的范围内，随着细胞密度的增加，10 μM OHP 作用 24 h 后，在 TM3 细胞中，OHP 对细胞增殖抑制作用逐渐降低，而在 I-10 细胞中，OHP 对细胞增殖抑制作用逐渐增强。 5. 增强 GJ 功能对 OHP 细胞毒性的影响 5.1 GJ 功能增强剂对 TM3、I-10 细胞 GJ 功能的影响 细胞接种荧光示踪法（Parachute Assay）实验结果表明，10 μM 维甲酸(ratinoic acid，RA)处理细胞 24 h，细胞荧光传递功能显著增强，TM3、I-10 细胞荧光传递 分别增强了 40.36%±0.03、41.23%±0.04。 5.2 增强 GJ 功能后 OHP 对 TM3、I-10 细胞增殖抑制作用的变化 采用 MTT 法检测 10 μM RA 对 OHP 细胞增殖抑制的影响，实验结果表明，在 高密度接种的睾丸细胞（生长融合，有 GJ 形成），10 μM