miR21在白血病发病过程中的作用研究　.docVIP

miR21在白血病发病过程中的作用研究 ：张帅王萍玉尹娟李有杰马颖谢书阳 】目的本实验旨在研究miR?21在白血病细胞中 表达情况，探讨miR?21基因与白血病发病的关系。方法提 取组织中的小于200bp的RNA，用poly (A)聚合酶在其3末 端加尾，再用5带40nt延伸序列的单碱基锚定Olig?dT 引物进行反转录，然后用特异引物进行real?timePCR扩增， 从而检测部分miRNAs在白血病细胞株K562中的表达，并 与正常人骨髓表达情况相对比。结果通过r eal ?timePC R 分析，癌基因miR ?21在K 562细胞中的表达量约为(土) X105个拷贝，明显高于正常人骨髓组织中miR?21的表达 (POo结论本研究表明miR?21在K56 2细胞中的表达量 增高，可能在白血病的发生过程中起重要作用。 关键词】实时定量PCR; miR?21 ；白血病；基因表达 Abst rac t] Object iv eStudingt h eexpressio nofmiR?21in leukemiacel lstoexplor e therelati on shipbetw een miR?21a ndde velopm entof leuke mia. Me thod sAfterl ess than200b pm iRNAwasis o latedandad dedwithpoly Aat3UTRbyp olymeraseA，themiRNAw as reversel yco nscript edby using4 Ontsp ecifi cprime rsfo rreal?t ime PCRat5’ e nd .Then, the e xpressiono fmiR?21wasd etectedinK5 62cellsand b onemarrow ce llsofhea 1th Theexpr essi onleve lofmi R?21i nK562c ellw as (土)XI 05c opies, ob vi ouslyhigh e rthanthati nhealthpeop lebonemarro wcellsbyre a l?timePCR an alysis (P ) . Conclus ionT hestud ydemo nstra tedtha tthe express ion ofmiR?21 wa sup?regul a tedinleuke miacells, wh ichmayplaya nimportant r oleinleuk em iadevelo pme nt. Keywo rds】r ea?tim ePCR，miR?21，le ukemia，g en eexpressi o n MicroRN A (miRNA)是近几年在真核生物中发现的一类具 有调控功能的非编码RNA，大小约为21?25个碱基的单链小 分子RNA。mi RNA能调节生物体生长、发育和疾病发生过程 中有关基因的表达［1，2］，推测这种小分子调控人类近1/ 3的基因，平均每个mi RNA可调节人类200种不同的mRNA 表达，并且多个miRNA能够协调调节一些特殊的靶基因 ［3］。研宄发现mi RNAs在正常血细胞分化过程中发挥着重 要作用，因此mi RNAs的异常表达可能与血液系统疾病的发 生和发展密切相关。 目前，随着生物信息学的发展和靶基因实验的确定， 有助于揭示mi RNAs在调控正常血细胞分化以及相关血液系 统肿瘤中的详细分子机制，miRNAs的检测有望成为某些血 液系统肿瘤的诊断方法，miRNAs及其靶基因的表达控制也 可能成为治疗某些血液系统肿瘤的手段。本研究旨在应用 real?tim ePCR研究miR?2 1在白血病细胞中表达情况，探 讨其与白血病发病的关系。 1材料与方法 细胞培养K5 62细胞用10%胎牛血清的DM EM培养基， 于5%CO 2、37 °C条件下培养。正常人的骨髓细胞由山东省 烟台山医院提供。 小RNA的提取用mir VanaTMmiRNA提取分离试剂盒(Am b ion公司)从白血病细胞株K562细胞中分离小片断RNA(彡 200 nt)。按说明书步骤，从1X10 6个细胞中提取出小片 段RNA溶解在30 yl的无RNA酶水中，紫外分光光度计定 量。 miRNA的克隆和逆转录取PgRNA和5U多聚(poly)腺 苷酸(A)聚合酶置于5 Oul反应管中，37°C条件下30mi n 进行小RNA的多聚腺苷酸化。将带有po ly(A)尾的小RN A 溶于适量无R NA酶H20中，在20 y 1体积中，应用Gen e Racer试剂盒Su perScriptTM