实验一-双向免疫扩散试验.docVIP

华南农业大学 200930220121 龙志敏 09制药一班 PAGE PAGE 2 2012/5/27 实验一 双向免疫扩散试验 一、实验目的 1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤 2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术 二、实验原理 在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。 利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20 万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。 双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。 三、实验仪器和试剂 1、仪器设备 载玻片、打孔器和挑针、湿盒、恒温箱、三角瓶、移液管、微量移液器 2、试剂和材料 （1）生理盐水 （2）1.2%琼脂胶：称取1.2 g 琼脂糖，加100mL 生理盐水，加热溶解 （3）抗原及相应免疫血清：抗原为人IgG，抗体为羊抗人IgG 免疫血清 四、实验步骤 1、制备琼脂玻片：将已加热溶化的1.2%琼脂5mL，迅速倾入洁净干燥的载玻片上，室温自然冷却凝固。 2、打孔：在凝固的琼脂糖胶上用打孔器或吸嘴按图1 打梅花孔（孔径约3mm，孔距4mm），用针头小心挑去琼脂。为便于识别加样方向或区分不同的组，可在琼脂糖胶边缘打上小孔或切角标记。打孔完毕，将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液。 3、稀释免疫血清：取5 支0.5mL 的离心管，各加入10μL 生理盐水。如图2 所示，取10μL 免疫血清加入1 号管中，吸打使其与生理盐水混匀，即为1︰2 稀释血清；再从1 号管吸取1︰2 稀释血清10μL 加入2 号管中，吸打混匀，即为1︰4 稀释血清；重复操作，获得1︰8、1︰16 和1︰32倍比稀释血清。 图2 倍比稀释免疫血清 4、加样：以上方孔为第1 孔，按顺时针方向分别称为2、3、4、5 和6 孔。抗原加入中心孔，倍比稀释的免疫血清加入周围孔，留1 孔加生理盐水，以作空白对照，每孔加样10μL。 5、温育：将琼脂糖胶置于湿盒（饭盒垫上纱布，加蒸馏水润湿）中，37℃温育12-24 h 6、结果观察：观察抗原抗体产生的白色沉淀线。免疫血清的滴度以一定抗原浓度下出现白色沉淀线的最高稀释度来表示。 五、注意事项 1、制备琼脂玻片时，用移液管向玻片加上琼脂时，要一次性迅速完成，防止形成气泡或在移液管中凝固，影响操作或结果。 2、打孔时，其他六个孔要尽量围着中间孔呈圆形均匀分布。 2、注意记录琼脂糖胶的标记和加样顺序。 六、结果分析 试验结果如右图所示:从图中我们可以看到一条白色沉淀线，说明以人IgG与羊抗人IgG 免疫血清相关，在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物。而这条线沿着各孔边缘弯曲，且随着血清浓度从第一孔到第五孔递减，第六孔为生理盐水，其颜色从第一孔到第五孔逐渐变浅，到第六孔消失。这符合试验原理，证明试验操作成功。 七、问题讨论 1、为什么将载玻片在酒精灯火焰上方过几遍，可防止漏液？ 答：因为加温可以使琼脂溶解，封闭住打孔可能产生的细小裂痕，以免试剂随裂痕漏出影响实验结果判定