太湖地区和皖南地区中华蜜蜂微卫星DNAひ糯多样性分析.docVIP

太湖地区和皖南地区中华蜜蜂微卫星DNAひ糯多样性分析 　　摘要：利用筛选后的2对荧光标记微卫星引物，研究太湖地区与皖南山区中华蜜蜂（以下简称中蜂）间的遗传多样性并分析其遗传分化。研究检测判定了60个中蜂个体的基因型，计算2个群体的优势等位基因频率（i）、期望杂合度（He）、多态信息含量（IC）、群体内近交系数（Fis），并分析中蜂群体内与群体间的遗传变异，采取配对试验均数差异t检验比较太湖中蜂与皖南中蜂群体的遗传差异。结果表明，太湖地区与皖南山区2个中蜂群体间的i、He、IC、Fis差异均不显著（i=0356005，He=039005，IC=0260005，Fis=0428005）。可见，太湖地区与皖南地区两地中蜂群体存在一定的遗传多样性，但遗传分化程度不大。本研究结果对江苏与安徽两地中华蜜蜂品种的选育和保护也具有一定的指导意义。 　　关键词：太湖地区；皖南地区；中华蜜蜂；微卫星DNA标记；遗传多样性 　　中图分类号： S898文献标志码： A[HK] 　　文章编号：002-302（204）2-002-05 　　中华蜜蜂（Apis cerana cerana）简称中蜂，指分布于我国境内东方蜜蜂地理亚种的总称，是我国特有的遗传资源，家养历史悠久，2006年被列入国家畜禽保护名录中。江苏省自古是我国野生中蜂的聚居区，也是最早引入新法饲养的地区之一[2]。近几十年来，由于西方蜜蜂大量引入及自然条件的破坏，江苏省中蜂遗传资源已消失迨尽，目前仅在环太湖地区略有分布，种质资源保护迫在眉睫[3]。同时，随着近几年环太湖地区设施农业的快速发展，蜜蜂授粉尤其是中蜂授粉的需求越来越多，现有的中蜂资源已不能满足农业生产的需求。皖南地区地形复杂，植被丰富，适宜中蜂栖息，中蜂资源十分丰富[4]，而且皖南地区与太湖地区相隔较近，没有任何地理隔离，所以从皖南地区引入蜂群可能是解决太湖地区中蜂资源缺乏的有效方法。但是引入后是否会改变太湖地区原有中蜂的遗传结构，继而对当地种质资源保护造成负面影响是应该考虑的首要问题，所以需要对2个地区现有中蜂资源的遗传结构与遗传多样性进行比较分析。 　　微卫星是目前普遍使用的分子遗传标记，具有多态性好、共显性、易于鉴定、检测重复性好、在基因组分布广泛等优点。联合国粮农组织（FAO）在其持续发展和管理动物遗传资源的战略计划中，推荐将微卫星标记作为优先考虑的分析工具[5-6]。近几年来，微卫星标记已广泛应用于我国各地蜜蜂种质资源的分析中，但是目前普遍采用聚丙烯酰胺电泳加放射显影或银染的方法，不仅费时费力效率低，而且误差较大[7-9]。本研究利用筛选后的2对荧光标记微卫星引物对太湖地区与皖南地区的中蜂进行遗传多样性比较和遗传分化分析，旨在初步评价2个地区中蜂群体遗传结构的差异，继而探讨江苏省太湖地区异地引入蜂群的可能性。 　　材料与方法 　　试验材料 　　太湖地区中蜂（DS）来自于江苏省苏州市吴中区东山镇，皖南山区中蜂（X）来自于安徽省宣城市泾县山区，每个地区各随机选取30群，蜂群尽量以野生种群为主，每群随机采集成年工蜂0只，用无水乙醇溶液浸泡保存。中蜂群体的采集信息见表。 　　参照吉挺所建立的方法[0]提取中蜂基因组DNA，用微量紫外可见光度计（NanoDrop ND-000）测定其含量与纯度，-20 ℃ 保存备用。 　　2微卫星引物的筛选及CR条件的优化 　　根据笔者所在课题组对中华蜜蜂转录组测序结果所获得的3 000多个微卫星位点进行筛选，每条染色体选择2～3对微卫星引物，共初步选取54对微卫星引物，送往上海生工生物工程有限公司合成。根据GenBank和相应文献提供的微卫星引物对所选54对引物进行优化，进一步筛选出 30对扩增效果较好的微卫星引物，具体所选微卫星引物信息见表2。 　　由于CR反应中影响因素较多，试验分别设计了以DNA模板浓度、Mg2浓度、Taq酶用量、退火温度为因素的梯度试验，最终确定CR的反应体系：0×Buffer 20 μL，25 mmol/L MgCl2 0 μL，0 mmol/L dNTs 05 μL，0 pmol/μL 上游引物 0 μL，0 pmol/μL 下游引物 0 μL，5 U/μL Taq DNA聚 　　配制3%琼脂糖凝胶，点样6 μL，20 V电泳20 min，检查产物的有无。如有产物，配制8%聚丙烯酰胺凝胶80 mL体系，00 V预电泳5 min，点样0 μL，20 V电泳3 h。进行硝酸银染色，直至出现清晰的等位基因条带。 　　4荧光引物的筛选和组合 　　根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，尽量选择不同染色体上的标记，淘汰掉无法扩增以及无多态性的引物，最终选出相对较理想的2对多态性较丰富的微卫星引物：7-CL278Contig（）、5-CL4Contig（γ