细胞实验技术-课堂-第九讲 细胞培养总结课件.pptx

细胞培养总结Cell Culture细胞生物学教研室一、细胞培养技术回顾（一）细胞培养所用制品的清洗与消毒在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感，这些物质若有残留，会影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗（二）细胞培养常用试剂1：水细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水 2：细胞培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基常用的培养基种类RPMI-1640、高糖DMEM、低糖DMEM、F12 等细胞培养基应用选择选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 4: 平衡盐液体组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分用于洗涤组织、细胞等D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)KCl0.40 gKH2PO40.06 gNaCl8.00 gNa2CO30.35 gNa2HPO40.048 gD-Glucose1.00 gPhenol Red0.01 gPBS（Phosphate-Buffered Sallines） KCl0.20g KH2PO4 0.20g NaCl8.00g Na2HPO4·7H2O2.16gDPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）标准型CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)0.10 gKCl0.20 gKH2PO40.20 gMgCl2·6H2O0.10 gNaCl8.00 gNa2HPO4·7H2O2.16 g5：消化液分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液单独或混合使用6：pH 调整液NaHCO3 溶液常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液羟乙基哌秦乙硫磺酸，一种弱酸，无细胞毒性主要作用：防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。HEPES配制使用终浓度一般为10-50 mmol/L常配成1M 储存液：用20 ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100 ml培养液中加入2ml HEPES储存液，终浓度为20 mmol/L 7：谷氨酰胺补充液谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4℃下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，临用前加入培养液中；使用终浓度为1 – 4 mmol/L配制方法：一般配制为100倍储存液，浓度200 mmol/L（29.22 g/L）谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200 mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30℃），过滤除菌，分装，-20℃保存；使用时向100 ml培养液中加入0.5 – 2 ml储存液，终浓度为1 – 4 mmol/L 8：酚红大多数培养液中使用酚红作为pH 指示橙红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫红色表示碱性pH在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用9：抗生素溶液抗生素使用种类与浓度： 工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin (青霉素) 100 U/ml -20℃ G(+) streptomycin (链霉素) 100 ug/ml -20℃ G(+) , G(-) gentamicin (庆大霉素) 50 ug/ml -20℃ G(+) , G(-), 支原体amphotericin B (两性霉素B) 2.5 ug/ml -20℃真菌nystatin (制霉菌素)