实验一 氨基酸纸层析课件.pptVIP

;实 验 一氨基酸纸层析 学时：3;层析技术(chromatography 色谱技术);二、定义 层析技术， (chromatography 色谱技术) 是利用被分离的混合物中各组分的理化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度在流动相和固定相中进行分配，最终达到分离目的。 ;三、层析技术的种类 1、按流动相的状态分类： （1）液相层析（色谱） （2）气相层析（色谱）； 2、按固定相的使用形式分类： （1）柱层析(CC)（2）纸层析(PC)（3）薄层层析(TLC)； 3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类： （1）吸附层析 （2）分配层析 （3）离子交换层析 （4）凝胶层析 （5）亲和层析等。 ; 纸层析（paper chromatography，PC） ： 是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。 ; 分配层析法： 利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数α是一个常数即: α=溶质在固定相的浓度（Cs）/溶质在流动相的浓度（Cl）;溶剂系统： 由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相;有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。由于混合液中各种氨基酸的分配系数（α）不同，其在两相中的分配数量及移动速率，即比移值（Rf值）就不同，从而达到分离的目的。; 移动速率(比移值)： 原点到层析点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离; 影响Rf值的主要因素： Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及 两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体 积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物 质分配系数不同，Rf也就不同。 （1）物质的结构和分子极性： 物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也 就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间 的分配情况，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf 小；反之,Rf则较大。;（2）层析溶剂： 首先，溶剂的纯度要高,否则需经预先处理（酸碱抽提，重蒸馏，脱水干燥等）； 其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.05～0.85，样品被分离物质的组分的Rf之差最好大于0.05； 再次，有些溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇- 甲酸-水系统久放易引起酯化. ;（3）pH值： 溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf改变； 溶剂的pH还可以影响流动相的含水量，溶剂的酸碱度大，吸水量多，使极性物质的Rf增加（将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理）. ;（4）滤纸： 层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同； 另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.01～0.4M的HCl处理除去金属离子）. ;（5）室验室的温度和时间: 温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数； 也影响滤纸纤维的水合作用，影响固定相的体积；也显著 地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。层 析必须在恒温条件下进行，某些对温度敏感的溶剂系统， 最好不配制成饱和溶液。 层析时间长,Rf大。 ;（6）展开方式： 上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散） Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf较小。 （7）样品溶液中杂质： 如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。;1、实验材料： 谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品 2、仪器： (1)毛细管 (2)电热吹风机 (3)层析缸 (4)层析滤纸 (5)小型玻璃喷雾器(6)铅笔、直尺等。 3、试剂