《04 基因组学课件---基因组测序与序列组装》.ppt

Solexa基本原理 基因组DNA被随机打断成为小的DNA片断；并在DNA片断的两端连上接头(adapter) Solexa测序专用的测序芯片（flow cell）表面连接有一层单链引物（Primer）,单链状态的DNA片断与芯片表面的引物通过碱基互补被一端“锚定”在芯片上 通过扩增反应使得单链DNA成为双链DNA 双链再次变性后成为单链，其一端“锚定”在测序芯片上，另外一端（5’或3’）随机和附近的另外一个引物互补，被“锚定”住，形成“桥“(bridge) 在测序芯片上同时有上千万DNA单分子发生以上的反应 4中形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在测序芯片表面再次进行扩增，形成双链 双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增模板继续扩增反应 在反复进行30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆“DNA簇群” “DNA簇群”在Solexa测序仪上进行序列分析 测序反应：专利的“可逆性末端终结反应”，提高碱基合成来进行测序。四种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复，得出碱基的精确序列 Solexa测序原理 Solexa技术特色 每张测序芯片有8个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测； 一次实验可读取大于15亿个碱基/芯片 可精确读取重复序列，如：AAAAAAAAAAAAAAAAA,TTTTTTTTTTTTT 实验费用低，测序成本为传统测序方法的1/100 无需建库，自动化样品制备，简单，成本低 样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测（1 ug DNA即可以进行末端双向测序反应） 可以进行35碱基长度的末端双向测序反应 纳米孔道测序法——Nanopore 纳米孔道测序法 利用当单链DNA分子在外加电压下通过纳米尺寸的孔道时产生的离子电流阻滞来测序 电流阻滞的调制显示出分子的长度、组成、结构和动态行为 人类主要组织相容性复合区（MHC） 位于第6号染色体，全长3.6 x 106 bp，与人类免疫系统有关 诸如类风湿关节炎，牛皮藓等炎症以及从癌症到阅读障碍等不同的疾病均与该区的遗传缺陷有关（Beck，1999） 人类MHC区由224个基因座组成，其中有93个座位（41.5%）是直接通过基因组测序发现的 人类MHC区是迄今为止已测序的人类基因组中基因分布最密集的区域，平均每16 kb含一个基因，也是多态性最丰富的区域，有些座位等位基因成员超过200 EST测序的优点 mRNA可直接反转录为cDNA，并很易构建cDNA文库 只需一次cDNA测序即可获取EST的顺序，500 bp的cDNA序列足以鉴定所代表的基因 不必反复检测EST顺序的准确性 浏览测序（sequence skimming） 粗略分析初步测序结果从中寻找基因编码顺序的方法 4.4人类基因组的测序与组装 ?2001年2月由国际人类基因组测序联合体与Celera Genomics同时发表的两份人类基因组顺序草图是采用物理图与鸟枪法有机结合的技术路线完成的（Venter etal. 2001; International Human Genome Sequencing Consortium, 2001） 基因组计划专门术语 Sequence Raw sequence：Individual unassembled sequence reads, produced by sequencing of clones containing DNA inserts 原始序列：直接从克隆载体插入子阅读的单个序列，尚未组装 Paired-end sequence：Raw sequence obtained from both ends of a cloned insert in any vector, such as a plasmid or bacterial artificial chromosome 成对末端序列：从任何基因组文库的克隆插入子两端读取的原始序列，包括质粒、PAC和BAC载体插入子 Finished sequence：Complete sequence of a clone or genome, with an accuracy of at least 99.99% and no gaps 完成序列：已完成测序的任何一个克隆或基因组的序列，它们是连续的，不含任何内部间隙，误差率0.01% Coverage (or depth) ：The average number of times a nucleotide is represented by a