绿脓菌素诱导分化U937细胞氧化损伤及抗氧化剂对其保护作用实验研究.docVIP

绿脓菌素诱导分化U937细胞氧化损伤及抗氧化剂对其保护作用实验研究 　　摘要：目的 探讨绿脓菌素（ PCN ）诱导U937细胞氧化损伤及抗氧化剂（NAC和PDTC） 对其损伤的保护作用。方法 选择不同浓度PCN （5， 25和50μM）感染佛波酯（PMA）分化的U937细胞24h，选择最佳浓度PCN （25μM）进行感染实验。给予不同浓度的 NAC（ 5， 10 or 20 mM）及PDTC （ 50、100、200μM） 预处理U937细胞1h ，PCN 感染细胞24h后，应用试剂盒进行丙二醛（ MDA ）、乳酸脱氢酶（ LDH）、超氧化物歧化酶 （SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性以及谷胱甘肽（GSH）含量测定。结果 与正常对照组相比，模型组LDH漏出量增加，MDA含量增加，SOD及CAT活性下降，GSH含量下降，呈剂量依赖关系。与模型组相比，NAC及PDTC干预组均呈LDH漏出量减少，MDA含量减少，SOD及CAT活性升高，GSH含量增加，呈浓度依赖关系，组间比较差异有统计学意义。结论 PCN可以诱导U937细胞氧化损伤，并呈剂量依赖关系， NAC及PDTC对PCN诱导J774细胞氧化损伤具有保护作用。 　　关键词：绿脓菌素；氧化损伤； U937细胞； N-乙酰半胱氨酸； PDTC 　　绿脓菌素（pyocyanin，PCN）是铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）产生的一种蓝色的有活性的氧化还原次级代谢产物，能自由地穿透生物膜、干扰正常离子转运、打断细胞呼吸链、过量产生氧自由基导致细胞死亡，PCN被认为是氧化还原的活性产物，是重要的致病因子和促炎介质。近年研究显示[1]，PCN在A549人肺泡上皮细胞株和人支气管上皮细胞，能钝化过氧化氢酶，减少基因编码的过氧化氢酶的转录，在肺上皮细胞和内皮细胞，PCN也可调整谷胱甘肽（GSH）氧化还原周期性变化[2，3] ，提示氧自由基和氧化还原反应在PCN介导的损伤中具有重要作用。 　　目前关于PA与抗氧化剂的研究较多，然而，关于PCN与单核巨噬细胞氧化损伤，以及抗氧化剂之间的研究报告较少。本研究选用佛波酯分化后的U937细胞作为巨噬细胞模型，研究绿脓菌素感染巨噬细胞导致氧化损伤，并探讨抗氧化剂（包括NAC及PDTC）对巨噬细胞的保护作用，研究绿脓菌素感染宿主的发病机制，为今后PA感染的治疗提供新的思路。 　　1 资料与方法 　　1.1 细胞株及主要试剂 人白血病细胞株U937购自北京中科院细胞中心，用含10%小牛血清的RPMI 1640 培养基传代培养。RPMI 1640 购自华美公司，小牛血清购自Gibco公司，绿脓菌素购自Sigma公司，NAC及PDTC购自大连宝生物公司，谷胱甘肽检测试剂盒，南京建成生物工程公司，其他试剂均为进口或国产分析纯。 　　1.2 细胞培养与分化 常规进行U937细胞传代培养。取5-30代U937细胞（细胞浓度达1×109/L），应用PMA（10μg.L -1）诱导U937细胞分化，分化成熟后的U937细胞作为细胞模型用于以下实验[4，5]。 　　1.3 绿脓菌素感染细胞试验 将PMA分化的U937细胞洗涤后，将5、10、25μM绿脓菌素加入含U937细胞的培养基中，于37℃、5%CO2条件下孵育24h。收集培养上清，保存于-80℃冰箱中。 　　1.4 噻唑蓝（MTT）毒性实验 选择570 nm作为测试波长，于酶联免疫监测仪上检测各孔光吸收值（A值）并记录结果，应用MTT还原法进行检测。以吸光值为纵坐标、时间为横坐标绘制细胞生长曲线。通过如下公式进行细胞生长抑制率计算：即细胞生长抑制率/% = 1 - 实验组A值/对照组A值×100%。 　　1.5 LDH 活性及过氧化氢酶（CAT）活性检测 分别取细胞上清液，根据试剂盒的要求测定LDH及CAT活性。 　　1.6 MDA含量测定及SOD活性检测 分别取细胞上清液，根据试剂盒的要求测定MDA及SOD活性。 　　1.7 GSH含量测定 GSH含量的检测：利用二硫代二硝基苯甲酸与还原型GSH上的巯基反应，对生成的黄色化合物进行比色定量，具体操作步骤按说明书进行。蛋白含量的测定采用Bradford法进行。 　　1.8 统计学方法 实验数据采用SPSS18.0软件进行分析，所有计量资料以（x±s）表示，计量资料用Compare Means中的One-way ANOVA，组间两两比较采用Dunnett- t检验；以P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2. 1 U937细胞的分化 U937细胞常规传代培养为单个悬浮细胞。将U937细胞与10μg.L -1 PMA共培养8 h后，细胞形态开始发生改变：即由悬浮的、独立的小圆形细胞转变为贴壁的、成