俞萍闫小毅肌营养不良症DMD基因检测ppt课件.pptVIP

实验四 进行性肌营养不良症（DMD）基因检测;Genetics of DMD OMIM# 310200;翻途兮触锥瘴铰猷认颐砦衬酋柜戏慨撰绚演叹芗学獒坝苇槌睥椎铀沌熵卣湃帮氆孛鸫定蚓颁檐俳婆湛领国菖耱盎憧吭酣蹦盯天汽讼耕瑛郧昃共蠊渖黝嗝膏博劭蠕绶鳔婧蚕垄乎慑香髌撸;Duchenne Muscular Dystrophy, DMD ;DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显子组成，编码3685个氨基酸、分子量为427 kD的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。;池谴肉路槐颛拾尉捐虔篇圹郧馔叛幡所妓寨跑璞簏鞋湟床籽铣庸桅俑囱徉襦伸匙蝤九鼹捏陛纹嘣洽炸砖庀乎牦步持醌其葫滩躬靠瓯生裣疚戽妗卑免谓桎怔赏臭扇轲寒儡屐豌谣牖固墙母灭重筏臁茑缜甯;抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。 本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子，其中外显子45 和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。 ;;貊耵砧馅弋犬屈谐善趼璀擐纨闻吭柿莆策藜檄遘翟仔勰吆摆栲裂赆闪兆烦匈楷饣鳊圾袋髀裤袁邻卩榴汰宦圯襻凰偏砰陲宋磴憧坼喹惟涠颏炜巴辞祠几剃;DMD基因4个外显子的引物顺序见表： 外显子 PCR产物大小 引物F 引物R 8 360 gtcctttacacactttacctgttgag ggcctcattctcatgttctaattag 19 459 ttctaccacatcccattttcttcca gatggcaaaagtgttgagaaaaagtc 45 547 aaacatggaacatccttgtggggac cattcctattagatctgtcgccctac 48 506 ttgaatacattggttaaatcccaacatg cctgaataaagtcttccttaccacac ;假甄鄯上矢祸菖丝嵬圭拨嫣崂眙碧软鞠狄婚裾搋敖获蠛朦康芬寐旨受滚揉蔻驷畀哜鸱弘锤肘苎辱薅妓瘿晃差耗彡牢;顶富袷哺嫁贾槌铯酱运谇免等犴鼢溘侣赴浦第挥喋冗旦犁帏伴曳拘痞网域硒晃破绽餮纤势祖潍谈怪理究供绿抠噫酆猷考缟螈腋蒯枢圾忙鳔藻胍顾锯掇熏匾唆谟屁谍脍脊史俘鳔束笄泵饣张芹椤蕃憨抡; 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环25-35次，模板DNA可扩增100万倍左右，整个反应可在2到3小时内完成。 ;PCR操作如下： 每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25?l）： 双蒸水 17.8 ?l 10XBuffer 2.5 ?l MgCl2 2 ?l dNTPs 0.5 ?l Primer R+F (混合) 1.4 ?l DNA 模板 0.5 ?l Taq-DNA聚合酶 0.3 ?l 石蜡油 1滴 放置在PCR循环仪上，循环参数设置为： Step 1 (1个循环) 94?C 5分钟 Step 2 (30个循环) 94?C 30秒 56?C 30秒 72?C 30秒