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急性毒性评价试验与体外预测方法 　　急性毒性是化妆品安全性评价最基础的试验，通常包括经口和经皮途径，必要时对某些极端的暴露途径(如吸入)也应给予考虑。急性毒性的主要目的是观察化学物急性毒性效应、剂量－反应关系、靶器官病变及其可逆性等。自从1927年Trevan第一次引入了半数致死量(LD50)的概念以来，LD50成为急性毒性的主要指标，但是，从上世纪70年代开始，LD50试验受到科学界和动物福利主义者的广泛批评，此后，经典急性毒性试验方案经过了多次改进。2002年，经典的经口LD50试验被废除，取而代之以3项优化方法。之后，急性吸入毒性的试验方法也进行了修订，并于2009年被法规认可。 　　 　　一、急性毒性试验 　　 　　化妆品急性毒性是指经口或经皮肤途径一次接触或24小时内多次接触某一化学物质，或4小时内吸入暴露化学物所引起的不良效应。“一次”接触，在经口途径染毒时，是指瞬间给予实验动物染毒，在经呼吸道与皮肤染毒时，是指在一个规定的时间段内使实验动物持续接触化学物的过程。而“多次”接触是指当外源化学物毒性很低时，即使一次给予实验动物最大染毒剂量仍不能观察到毒性作用，从而需要在24小时内对实验动物进行多次染毒，以达到规定的限制剂量。急性毒性试验可以分为两类。一类是以死亡为毒性终点的经典试验，主要是求得LD50。另一类实验不以死亡为观察终点，这类试验可得到受试物靶器官毒性和非致死性不良反应的数据。传统的急性毒性试验属于第一类。1984年，英国毒理学会首先提出不应使用大量动物来获得看似精确的LD50值，1987年经典LD50试验法最先被欧洲委员会废除，2002年，被OECD指南废除。 　　对于“急性吸入毒性试验”，经典的动物试验于2009年得到了修订，增加了3R的内容和非LD50的程序。2008年，OECD认可了德国提出的“急性吸入毒性一急性毒性分类(ATC)方法”，其原理类似于经口毒性试验的ATC法。2009年，重复剂量吸入毒性(28天或14天试验)和亚慢性吸入物毒性(90天试验)也按照3R的原则进行了更新。急性皮肤毒性仍沿用动物试验，它是指受试物应用于实验动物不超过体表皮肤面积的10％，经过14天观察，病理学检查毒性变化主测定LD50值，急性皮肤毒性试验对于皮肤吸收和其它亚慢性皮肤毒性试验的剂量确定是有用的。 　　化妆品急性毒性试验一般选用成年健康哺乳动物，首选大鼠，其次是小鼠，特别必要时才选择非啮齿类动物(犬或猴)。试验前首先要了解受试物的化学结构和理化性质，根据受试物的用途和有关测试规范设计实验方案。对于新化学物，还应检索与其化学结构和理化性质相似的化学物的毒性文献资料，这样既能提高动物实验结果的有效性和准确性，对于减少和优化实验动物的使用也是必需的。急性毒性的内涵是很丰富的，不能简单地理解为只是LD50的测定。试验结果的观察记录内容主要包括4个方面，即临床症状及发生过程、死亡情况和时间分布、体重和病理形态变化。观察时间一般要求14天。 　　 　　二、急性毒性试验的替代方法 　　 　　从法规的角度讲，化妆品急性毒性试验的主要目的是按照有关管理规定对其组份的固有毒性进行基本了解和分类，目的是保护公众健康。目前急性经口毒性试验的优化方法共有3项，即是固定剂量程序法(OECD TG 420)，急性毒性分类方法(OECD TG 423)和上下程序法(OECD TG 425)。每种方法均需预设剂量，开始剂量的确定可基于小范围内的预试验研究、细胞毒性筛选或已有资料进行分析。染毒后，观察动物明显的毒性症状，包括死亡(ATC或UDP)，或毒性症状(如FDP)。在欧美等国家以死亡为终点的试验已被所有法规废除，因此急性毒性试验中替代方法的使用已成为强制性的方法。三种替代方法中，ATC法最常用(在欧洲约50％的经口毒性试验采用此方法)。 　　 　　1　固定剂量法 　　于1984年由英国毒理学会(BTS)最早提出。该试验不以动物死亡为观察终点，而是利用预先选定的或固定的一系列剂量染毒，从观察化学物的毒性反应体征作为终点来对化学物的毒性进行分级。该方法的价值在于使估计化学品急性经口毒性所需要的动物量达到最小。试验各组选用同一性别(通常选用雌性)动物，以5、50、300和2000mg／kg四个固定剂量(特殊需要可考虑增加5000mg／kg)顺次进行经口染毒。根据预试验结果确定的能够产生毒性反应但又不至于引起死亡的剂量作为起始剂量。根据毒性反应和死亡的有无来确定是否在更高剂量或更低剂量继续进行试验。出现下列情况情况结束试验：1)当出现明显的毒性反应或已确认不多于一只动物死亡；2)最高剂量未出现毒性反应；3)最低剂量动物出现死亡。以初始剂量为50mg／kg为例，5只实验动物(包括预试验1只)，如果死亡数≥2只，则再选择一组动物给予5mg／kg的受试物