PCR反应条件的确定变性退火延伸循环数.PPTVIP

35 35 35 实验二、 目的基因片断的体外扩增 讲解 （2） 一、PCR 的概念 二、PCR 的基本原理 三、PCR 的基本流程 四、PCR反应体系的各成分及其对PCR的影响 讲解内容 (2) 五、PCR反应条件的确定 六、常见问题与对策 变性 退火 延伸 循环次数 主要包括： Half life of Taq DNA polymerase 一般选用94～95 ℃。 92.5 ℃ 2 hours， 95 ℃ 40 mins， 97 ℃ 5 mins. 30 个循环时， 变性温度： 变性时间： 可根据模板长短、G+C含量确定。 一般采用30～45秒。 五、PCR反应条件的确定 变性共需要 15 ~ 22.5 min。 热启动 : 94℃（或95℃）, 3～10min 变性 退火 延伸 循环次数 主要包括： 五、PCR反应条件的确定 退火是影响 PCR 特异性的重要因素！ (2) Annealing temperature is too high Primers and templates tends to be dissociated. (2) Annealing temperature is too low Mismatched hybrid. (1) Correct annealing temperature Priming occures only at the desired target sites. (1) 退火温度偏高，产物量减少，但反应特异性 (specificity)高。 退火温度 对 PCR 反应的影响： (3) (2) 五、PCR反应条件的确定 变性 退火 延伸 循环数 主要包括： 长度 20 mer 的引物， Tm 计算公式为：＝4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 退火温度 = Tm －（2～10℃） 退火温度：50℃~65℃。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55 ℃作为退火温度的起点较为理想。 较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。 但退火温度不能太高，要保证引物同目的序列有效退火。 通过参考引物的 Tm 值，选择退火温度 Tm (melting temperature, 解链温度) : 当 50％ 的引物与互补序列表现为双链DNA分子时的温度。 五、PCR反应条件的确定 变性 退火 延伸 循环次数 主要包括： Taq 酶的最适工作温度：72℃或74℃ 温度： 取决于待扩增基因片段的长短 酶的延伸效率： 约 1kb/min。 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 时间： 五、PCR反应条件的确定 变性 退火 延伸 循环次数 主要包括： 决定了 PCR 扩增程度 一般地， 30 cycles 循环次数过多会增加碱基的错配几率，非特异性产物的量亦增多。 95℃, 5 min 94℃ 45S，55℃ 1min，72℃ 2min。 30 个循环 。 72℃ 延伸10min。 典型的PCR条件： 六、常见问题与对策 无扩增产物 假阳性 非特异性扩增 拖尾 主要包括： 1) 模板: ① 提取的模板中含有杂质。如：蛋白质、氯仿、 乙醇、EDTA等抑制了Taq 酶活性 ② 模板的浓度可能不合适。 2) 引物： ① 引物设计不合理：如，特异性长度不够，引物二聚体等。 ② 选择一个好的引物合成公司。 ③ 引物应高浓度小量分装冻存，防止多次冻融导致引物发生降解。 3) 酶失活 反应体系方面的原因 无扩增产物 假阳性 非特异性扩增 拖尾 1）变性: 不彻底； 2）退火: 温度太高； 3）延伸: 时间太短。 六、常见问题与对策 主要包括： 反应条件方面的原因 无扩增产物 假阳性 非特异性扩增 拖尾 六、常见问题与对策 主要包括： PCR是一项非常敏感的技术，极微量的靶序列的污染便可导致假阳性。 空白对照管（无模板）出现扩增产物 实验室中PCR扩增产物、重组质粒的污染； 实验室中加样器、白衣、 PCR试剂的污染； 空气中灰尘的污染； 标本间交叉污染 合理分隔实验室 隔离专用操作区； 离心管、枪头等一次性使用,不要碰到别处； 除酶等不能耐高温的物质外，所有试剂、器材均高压。 各种试