人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中构建与表达研究.docVIP

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中构建与表达研究 　　[摘要] 目的 构建NKG5突变基因的原核表达载体并进行表达研究。 方法 采用寡核苷酸合成的方法，拼接成为NKG5-Ser的编码序列，克隆到pGEMT载体上，测序正确后，再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T-1中，重组表达载体转化大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS，用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。 结果 成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser，转染大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS，诱导表达后，SDS和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量（Mr）为35 kD的蛋白条带，证明融合蛋白表达成功。 结论 获得了突变NKG5与GST的融合蛋白，为进一步的工作打下了基础。 　　[关键词] 颗粒裂解肽；突变基因；融合蛋白；原核表达 　　[中图分类号] R978.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（b）-0026-04 　　最初是由Jongstra等发现的一种短肽，称为519，1997年Pena等把这种短肽命名为颗粒裂解肽（NKG5）[1-2]；NKG5是一种细胞毒性效应蛋白，属于SAPLIP（saposin like protein）家族成员，它能够选择性地在NK细胞和激活后的T淋巴细胞中表达，其天然肽和重组肽都具有广谱抗菌活性，对G+和G-细菌、真菌、寄生虫均有杀菌活力，如鼠伤寒沙门菌、单核李司特菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌，真菌有新型隐球菌、白念珠菌，寄生虫有利什曼虫，尤其是对分枝杆菌有直接的细胞毒性[1]，它与穿孔素和粒酶在溶淋巴颗粒上有协同作用[3]。 　　引起笔者注意的是NKG5在体外不仅表现为对结核分枝杆菌很强的杀伤作用，且协同穿孔素对细胞内的结核杆菌也有很强的杀伤能力[3-5]。文献报道，颗粒裂解肽在72 h 内可以杀灭90%的哺乳动物结核菌素（MTB），其杀灭作用呈剂量依赖性[6]。 　　众所周知，对结核杆菌有效的药物最早是30年前发现的，更为严重的是结核杆菌对为数很少的治疗药物均已产生了不同程度的耐药性。全球亟需对付结核杆菌的有效措施，包括预防性和治疗性疫苗与新型药物，而NKG5有可能成为抗结核病的一种新型生物制剂。因此，笔者所在课题组开展了一系列针对NKG5的研究。本论文根据从Genebank中报道的NKG5基因序列，设计把NKG5的部分氨基酸编码Cys69、96、107、132、138位变为Ser，采用寡核苷酸合成方式，通过分子生物学技术拼接成为NKG5-Ser编码序列，然后在原核细胞中融合表达，拟为进一步对比研究颗粒裂解肽杀灭结核菌的功能提供基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　PCR产物纯化试剂盒购于Qiagen，限制性内切酶 XhoⅠ和 BamHⅠ、T4 DNA连接酶购自NEB，2×pfu、Master Mix、DNA mole wheight marker、羊抗小鼠GST单抗和HRP标记的羊IgG购自天根生物技术（北京）有限公司，发光试剂盒购、GST纯化树脂和还原型谷胱甘肽购自威格拉斯生物技术（北京）有限公司，Red Taq购自赛百盛生物技术有限公司；pGEX-4T-1、大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS、DH5α由解放军第三?九医院结核病研究所分子生物学实验室保存。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计 有哪些信誉好的足球投注网站Gene bank中hNKG5的cDNA序列（登录号：NM 006433），设计合成氨基酸编码全序列并设计一对引物，其序列如下（下划线部分为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点）上游引物5′-CTACTAGCTAGCGGATCCGGCCGTGACTACCGCACC-3′，下游引物5′-CATCGCTCG AGCTCATTATGGACCTGTAGAAGGGATACTCAAACGGAGGTCCTCG C-3′。 　　1.2.2 颗粒裂解肽氨基酸编码序列的克隆及序列测定 采用合成的寡核苷酸序列，拼接成NKG5-Ser目的基因，将纯化的目的片段连接到克隆载体pGEMT 中，转化入处于感受态的大肠埃希菌DH5α，涂布于含有相应抗生素的LB琼脂培养基上，以蓝白斑筛选方法初步筛选阳性克隆，挑取准阳性的单个白色菌落，提取质粒，进行PCR鉴定，并且对阳性重组子进一步提取质粒后进行双酶切确定其重组片段的大小，最后选择重组质粒（pGEMT-NKG5-Se）在ABI PRISMTM 3700型DNA自动测序仪上测序（由上海生工生物工程技术服务有限公司生产）。 　　1.2.3 原核表达载体的构建及其表达 用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切重组质粒pGEMT-NKG5-Ser，回收目的基因，将其进一步克隆到被同样双酶切的原核表达载体pGEX-4T-1中，构建重组的原核表达载体（pGEX-4T-1-NKG