超滤膜截留-二氧化钛选择性富集-纳升级液相色谱-串联质谱法检测血清中内源性磷酸化肽.docVIP

超滤膜截留-二氧化钛选择性富集-纳升级液相色谱-串联质谱法检测血清中内源性磷酸化肽 摘 要 采用超滤膜（ultrafiltration membrane）去除血清中的大量高丰度蛋白、dna和rna等大分子量干扰化合物，然后利用tio2富集超滤膜滤过液中的磷酸化肽，结合纳升级超高压液相色谱四极杆飞行时间质谱（nano uplcqtof）分离和检测技术，提高了内源性磷酸化肽的检测灵敏度；将本方法应用于肺癌患者血清中的内源性磷酸化肽分析，成功检测到18种内源性磷酸化肽。本方法实现了高灵敏度、高选择性血清中内源性磷酸化肽的富集和检测，为肿瘤生物标志物的发现奠定了方法学基础。 关键词 超滤膜；tio2富集；内源性磷酸化肽；nano uplcqtof 1 引 言 蛋白质磷酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰（post translational modifications, ptms），参与并调控着生命活动的几乎所有过程，包括细胞增殖、分化，神经活动和新陈代谢等[1,2]。异常的蛋白质磷酸化是人类疾病发生的根本原因之一[3]。所以建立高灵敏度和高通量的磷酸化蛋白检测方法，对于进一步理解生命进程、发现与疾病相关的生物标志物具有重要意义。目前，由于生物样品中磷酸化肽的含量低，并且在质谱检测中大量的非磷酸化肽段严重抑制磷酸化肽的离子信号[4,5]， 导致对磷酸化蛋白的鉴定具有挑战性。因此在质谱分析前高选择性地富集磷酸化肽非常重要[6，7]。固定金属离子亲和色谱（imac）[8]， 如ga3＋imac和fe3＋imac和金属氧化物亲和色谱（moac）[9]，如tio2和zro2等，因其对磷酸化肽的高选择性被广泛应用于磷酸化蛋白组学研究中。 血清中含有来源于几乎所有细胞、组织的蛋白及代谢产物，能够直接反映机体的生理、病理状况，为各种疾病研究提供最有价值的信息[10]。但由于血清成分极其复杂，同时具有很宽的动态范围，使得血清中内源性磷酸化肽的检测面临很大的困难，相关报道很少。hu等[11]利用一种基于有序介孔材料的固定化钛离子亲和色谱（ti4＋imac）材料直接从人血清中富集并检测到4种内源性磷酸化肽。本研究组[12]利用zro2包覆介孔氧化硅材料直接从人血清中富集到12种内源性磷酸化肽。以上两种方法都是利用磷酸化肽中的磷酸根与富集材料中的金属元素相互作用实现了磷酸化肽的选择性富集。但是血清样品中含有大量的脱氧核糖核酸（dna）、核糖核酸（rna）及磷酸化蛋白等大分子化合物，这些化合物都含有磷酸根，特别是rna和dna, 它们可能在上样过程中与低丰度的磷酸化肽竞争富集材料上的作用位点，从而降低了血清中磷酸化肽的富集选择性。因此，如何有效去除这些大分子量的干扰化合物，提高血清中低丰度磷酸化肽富集检测方法至关重要。 本研究采用超滤膜（ultrafiltration membrane）去除血清中的大量高丰度蛋白、dna和rna等大分子量干扰化合物，减少了在上样过程中与磷酸化肽竞争作用位点的干扰物，提高了tio2富集磷酸化肽的选择性，结合纳升级超高压液相色谱四极杆飞行时间质谱（nano uplcqtof）分离和检测技术，从肺癌患者血清中共检测到18种内源性磷酸化肽，明显提高了内源性血清磷酸化肽的检测灵敏度。 2 实验部分 2.1 材料与试剂 geloader枪头 （德国eppendorf公司）； c18aq材料 （德国sunchrom公司）；3 k、10 k超滤膜、tio2材料 （日本gl sciences 公司）；α酪蛋白、三氟乙酸 （tfa）、乳酸 （la）、nh4hco3 （美国 sigmαaldrich 公司）; 测序级胰蛋白酶 （美国promega公司）; 乙腈 （can，德国merck公司）；甲酸 （fa，比利时acros公司）；超纯水由millq制备 （美国millipore公司）；10%氨水溶液 （瑞士fluka公司）。 2.2 酶解 将1 mg标准品α酪蛋白溶解于1 ml 50 mmol/l nh4hco3 （ph 8.0） 溶液中，蛋白与胰蛋白酶按照40∶1（质量比）充分混合。在37 ℃下酶解12 h后，加入终浓度为0.5%甲酸终止反应。酶解液分装后，在－70 ℃冰箱保存备用。 2.3 标准品的超滤膜过滤 将不同剂量的α酪蛋白酶解液与50% ch3oh0.5% fa溶剂充分混匀，将混合液移至10 k和/或3 k超滤膜中，在高速台式冷冻离心机 （美国fisher公司） 上，以13000 r/min离心60 min。取出滤过液（通过超滤膜）并旋干，再溶于40 ?symbolma