生化分析-化学检测技术..pptVIP

化学检测技术 化学与生命科学学院 第一节 糖类的化学检测 碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类化合物。 自然界中糖类包括多糖、双糖、单糖 单糖和某些双糖具有游离羰基——还原糖 多糖和蔗糖等无还原性——非还原糖 二、糖类的化学检测原理 糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。 非还原糖必须转化为还原糖再进行测定。 最常用的试剂：斐林（Fehling）试剂 斐林试剂基本组成： A：CuSO4 溶液 B：NaOH和酒石酸钾钠 溶液 使用时A、B等体积混合(生成酒石酸钾钠铜） 1、兰－爱农（Lane-Eynon）法 本方法又称次甲基蓝法、置换法、直接滴定法 用次甲基蓝作为指示剂，直接用还原糖滴定到斐林试剂中进行测定的方法。 由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1滴还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失！ 2、斐林试剂快速法（GB法）： 在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）。红色的氧化亚铜沉淀与亚铁氰化钾络合生成可溶性的复盐，反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。 第二节 蛋白质和氨基酸的化学检测 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。 一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。 蛋白质含有多个肽键，因此可用双缩脲试剂及由其发展而来的福林－酚试剂进行蛋白质的测定。 蛋白质的基本组成单位是氨基酸。通过末端氨基酸分析，则可弄清蛋白质中氨基酸的种类和排列顺序。 一、定氮法测定蛋白质的含量 凯氏定氮法或微量凯氏定氮法（经典的，仲裁的） 1. 原 理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 消化： 取一定量样品放进凯氏定氮瓶，加入一定量K2SO4 、 CuSO4、浓H2SO4， 通风厨内进行。消化结束，消化液全部移入100mL容量瓶定容。 A.硫酸钾的作用 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4 K2SO4+H2O↑+SO3 　　一般纯硫酸的沸点在340℃左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到400℃以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高。 　 但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4 NH3↑+ (NH4)HSO4 2(NH4)HSO4 2NH3↑+ 2SO3↑+ 2H2O B.硫酸铜的作用 ① 催化剂 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 ② 可以指示消化终点的到达。 （2）蒸馏、吸收 （2）蒸馏、吸收 接收瓶内加入2%硼酸溶液10ml 及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下； 准确吸取10.0ml样品消化稀释液由小玻杯流入反应室，并以10ml水洗涤小玻杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。 将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。 蒸馏5min，移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。 （3）滴定 全部蒸馏完毕后，用0.0100N标准盐酸溶液滴定接收瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变成淡紫红色，即为滴定终点。 3、自动凯氏定氮法 （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。 二、双缩脲试剂法测定蛋白质 蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。 蛋白质（多肽）＋CuSO4、NaOH→ 紫红色化合物（铜－钠双缩脲络合