外源基因在大肠杆菌中的表达..pptVIP

A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 改善基因工程菌不稳定性的策略 控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳定 7 外源基因在大肠杆菌中的表达 胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 人胰岛素的生产方法 直接提取法制人胰岛素 迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法： 早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料 供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临 床需求。 人胰岛素的生产方法 化学合成法制人胰岛素 根据人胰岛素A链和B链的序列，由单个氨基酸从头合成。这 条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产 成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。 包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠（refolding）：二硫键形成 在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有： 化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好 HS HS S S + 2e + 2H+ A HS HS S-S-R HS + B R-S-S-R S S 2R-SH 分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式： 即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中； 或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。 蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件 分泌型异源蛋白的表达 以分泌形式表达目的蛋白的优缺点 分泌表达形式的优点： 目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳 稳定性大约是在细胞质中的10倍 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有 甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质 N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠 杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去 分泌型异源蛋白的表达 以分泌形式表达目的蛋白的优缺点 分泌表达形式的缺点： 相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。 因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。 分泌型异源蛋白的表达 蛋白质的分泌机制 原核细菌周质中含有多种分子伴侣可阻止分泌蛋白的随机折叠，分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感 分泌型异源蛋白的表达 分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内膜上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。 因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。 此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。 融合型异源蛋白的表达 除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。 在这