激光共聚焦与流式细胞及电生理技术-荧光原理和激光共聚焦显微镜.pptVIP

三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞 Real-time Observation 激光扫描共聚焦显微镜特点 图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理； 分辨率提高，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位； 可以实时采集信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径； 除具有成像功能外，还有图象处理功能和细胞生物学功能。 1.虽然共聚焦显微镜能获取比普通显微镜更清晰的图片，但实际上共聚焦显微镜的分辨率只比普通光学显微镜有少量的提高，普通光学显微镜的分辨率理论极限大约是0.2微米，共聚焦显微镜的分辨率理论极限大约是0.15微米。 2.共聚焦显微镜的一大限制是成像速度较慢，这限制了其用来研究生物领域中的一些快事件。 共聚焦显微镜的局限 1）xy分辨率：Rxy=0.4波长/数值孔径，是传统显微镜Rxy(0.61波长/数值孔径)的1.4倍，但比起透射电子显微镜0.1nm的分辨率仍低很多，它是连接这两种常规技术的中间桥梁（11）。 2）待测样品最大厚度：约1-2mm. 3）样品最小光切厚度：40nm 4）Z轴最大分辨率：0.35um. 5）扫描速度：slow：单向：220lines/s 512x512 2-3秒 双向：440lines/s medium：单向：450 lines/s 512x512 1.7秒 双向：900 lines/s fast：单向：1000 lines/s 512x512 0.7秒 双向：2000 lines/s 主要技术指标 共聚焦激光扫描显微镜的应用 共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域 只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。 形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类…… 分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移?大分子构象的改变、受体与配体相互作用…… 活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+等离子的动态分布 及动态定量、荧光漂白恢复?细胞连接间的信息沟通…… 直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统 的局限性：荧光漂白 Intensity Before bleach After bleach 90 min after bleach 1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP)检测细胞连接间的信息传递 2. 荧光能量共振转移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer) I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。 供体荧光素 受体荧光素 1.供体与受体间的距离 10nm或=1-7nm 2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠 II.荧光能量共振转移的条件 488nm 520nm 650nm 540nm 650nm 488nm 520nm 供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3) 供体荧光素 (Cy2) 受体荧光素 (Cy3) FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP Fluorescence Intensity Time 检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现荧光。 应用 ? 受体与配体的相互作用：亚基的 结合与分离 ? 大分子构象的改变 Ligand Cy3 Cy5 III. 常用荧光共振转移探针对 3. 绿色荧光蛋白（GFP） GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。 GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒 转基因动物: Green mouse 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监测外源基