第2节 基因工程菌构建的载体系统与工具.pptVIP

第二节 基因工程菌构建中的常用载体系统与工具 一、载体系统 载体类别 （一）质粒载体 Plasmid Vector 质粒（plasmid）是许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子，它是闭合环状的双链DNA分子，大小从1kb－200kb以上不等。 1、质粒的选择标记 A、．四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene, tetr）????四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 B、氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）????氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化 β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。 C、氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）????氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬菌体（也携带 Tn9）。cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。 D、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）????卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3）-Ⅱ, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。 E、琥珀突变抑制基因（Amber mutations suppressor genes， supF）????在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变（突变为 UGA）。 supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。相应的， supE 基因在 UAG 密码子上编译谷氨酰氨。由于目前所用的标记基因使用方便，因此用这类标记的载体较少。 2、质粒构建的策略 （1）缩短载体长度 （2）增加限制酶切点 （3）在质粒中引入多用途的辅助序列 ① 可用组织化学法鉴定重组体的质粒载体 ② 带有单链噬菌体复制起点的质粒载体 ③ 带有噬菌体启动子的质粒载体 ④ 可对重组体进行正选择的质粒载体 一、质粒载体 细菌质粒 (plasmid) 载体是基因工程 中最常用的载体, 它必须包括三种组成部分：复制必须区，选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点，MCS). 质粒DNA分子具有三种构型： Closed circle DNA, ccDNA; supercoil; SC构型（当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（ccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型 1. 严紧型和松驰型质粒 严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有1～3个 松驰型质粒：其拷贝数较多，一般20～60个，多的可达200～300个 质粒拷贝数，是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。 2、转移型和非转移型质粒 3. 质粒的不相容性和不亲和群 （二）质粒的命名 1、人工组建的质粒 （三）、常用质粒载体 1. pSC101 2. pBR322 （1）组成 （2）特点 （3）重组克隆的 “插入失活”筛选方法 3、pUC系列质粒载体 （1）特点 可用组化方法鉴别： 可通过插入失活法进行筛选 二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体 2、λ噬菌体的缺陷与改造 λ噬菌体的改造 3. λ噬菌体的主要类型 （1）插入型载体 （二）M13噬菌体载体 三、噬菌粒载体（科斯质粒　cosmid ） 四、酵母菌载体 整合型：含有酵母的筛选标记ura3，但不具有酵母的复制起始点该质粒DNA以单拷贝形式稳定