多糖结构方面.docVIP

多糖的提取、分离纯化 真菌多糖是从真菌细胞壁和组织体的菌丝之中分离出的由十个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物 。真菌多糖能通过对淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统而调节机体的免疫功能，在治疗肿瘤、心血管、肝炎、糖尿病，甚至爱滋病等方面显示出特殊的效果，有些已在临床上广泛应用[1]。真菌多糖作为药物毒性极小，其在治疗代谢紊乱、感染及癌症等疾病方面的应用正不断增加，它在医疗上是一种很好的佐料。真菌多糖其研究日益受到人们重视。 1 真菌多糖的提取、分离纯化与纯度检测 1.1 真菌多糖的提取和分离 提取真菌多糖的原料，应先用丙酮、乙醚或乙醇进行预处理，以除去原料中的脂类物质,然后用热水、稀酸或稀碱反复提取，提取液中和至中性后，用甲醇或乙醇沉淀，沉淀物经离心、干燥后，制得粗多糖。 1.1.1 粗多糖中蛋白的去除 常用的脱蛋白的方法主要有3种：Sevag法是用氯仿、正丁醇或正戊醇按5:1混合后,加到样品水溶液中振摇，离心除去凝胶状蛋白质，反复多次直至蛋白质除尽为止。三氟三氯乙烷法[2]是多糖溶液和三氟三氯乙烷1:1混合,在低温下搅拌10min左右,离心得上层溶液, 上层溶液继续用上述方法处理几次,即得无蛋白的多糖溶液。三氯乙酸法是在多糖水溶液中滴加3%的三氯乙酸，直至溶液不再浑浊为止，于5～10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白的的多糖溶液，但是此法会引起多糖的降解，不宜采用。另外还有硫酸铵法和蛋白酶法。 1.1.2脱色 多糖中所含的色素一般有两种，即游离色素和结合色素。游离色素大多呈阴离子状态，可以通过离子交换法除去，常用DEAE纤维素或DEAE-SepharoseTM Fast Flow来吸附色素。若多糖与色素结合，则色素易被离子交换柱吸附，不易被水洗脱，这类色素可采用氧化脱色：以浓氨水（或NaOH溶液）调至ph8.0左右，于50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2h；根据真菌多糖与色素的结合情况选择合适的脱色方法[3]。 1.1.3 除低聚糖等小分子杂质 通过逆向水流透析、选择不同的滤膜进行超滤或超速离心可以除去多糖中的低聚糖等小分子杂质。 1.2 真菌多糖的提纯与纯度检测 1.2.1 提纯 分级沉淀法常采用甲醇 、乙醇和丙酮等沉淀剂；柱层析[4] 和纤维柱层析：常用不同浓度乙醇水溶液由高到底进行洗脱，将各种多糖分离开来；纤维素阴离子交换柱层析法,常用的交换剂为DEAE-纤维素和ECTEOLA-纤维素，适用于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖；凝胶柱层析法常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、DEAE-Sephadex和DEAE-SepharoseTM Fast Flow,此法不适宜粘多糖的分离。 1.2.2 纯度检测 多糖的“纯”指的是一定分子量范围的均一组分，纯度只代表着相似链长的平均配布。常用的多糖纯度的检测方法较多超离心法的原理是根据在密度梯度超离心场中，密度大小和相同颗粒移动相同，60，000rpm离心，如样点在蔗糖梯度中呈单一峰，则认为是单一组分；纸层析法的结果呈现一集中斑点可认为是均一组分；高压电泳法是依据多糖分子在电场中的移动速度取决于其所带电荷的多少与分子的形状、大小，均一组分多糖电泳后染色呈单一色斑或单一峰；凝胶柱层析是若部分收集中出现单一对称峰则为单一组分；旋光测定法是依据化学组成相同，结构相同的多糖具有相同的旋光性；采用高压液相法时,凡在对多糖检测中形成对称的单一峰被视为组分单一。 1.2.3 分子量测定 从真菌中提取、纯化的多糖是一类分子量近似的高聚物分子的混合物，因此多糖的分子量是一个平均值。常用的分子量测定方法有渗透压法：利用膜渗透压计（MO仪）可以测定分子量范围在1～50万之间的多糖分子量；蒸汽压法：利用蒸汽压渗透计（VPO仪）可以测定分子量范围在500～10000之间的多糖分子量；端基法：通过测定单位重量样品中所含可测端基数，计算检样的分子量；光散射法：利用光散射分子量测定仪测定分子量；粘度法：先测定样品特性粘度η，然后通过换算方程，即经验式η=KMα，计算出分子量[5]，方积年[6]认为高效液相色谱法是真菌多糖最好的分子量测定法:用不同标准分子量的葡聚糖Detxran-T系列（分子量４000至200万的十个标准品）作对照，用高效液相色谱法测定，由lgMw对Rt作图获得标准曲线，然后在相同条件下获得样品层析图谱，由GPC（计算机软件）计算得分子量[7]。 多糖的结构解析 多糖的结构分析 真菌多糖的结构分析方法一般来说可以分为两大类：一类是传统的化学方法，一类是波谱学方法。下面简要介绍化学方法和波谱学方法在真菌多糖的结构分析方面的作用。 2.1 化学方法 此法是用来对一些简单的单糖、二糖和简单的寡糖进行分析的经典方