第二章 常规制片技术-1.pptVIP

第二章:常规制片技术（冰冻切片及石蜡切片技术） 刘苹 概述 制片方法的种类:非切片法, 切片法 制片的一般步骤: 1.切片法: 取材和固定;洗涤;脱水;透明;透入;包埋;切片;贴片;染色;封藏 2. 非切片法 整体封藏法,涂片法,压碎法 石蜡切片技术 石蜡切片法是将组织经过一系列化学试剂处理,使石蜡渗入组织,包埋成蜡块,再把组织块切成薄片,用不同的染色方法以显示不同细胞和组织形态,以及细胞和组织中化学或特殊成分(抗原)成分含量的变化. 一.取材 所取组织应包括脏器或组织的重要结构,同时考虑好切面方向;病理组织除取病变部位外,还要取病变和正常组织交界区域; 切取组织必须新鲜.取材后立即投入固定液中,否则组织会发生收缩,自溶现象; 切取组织,刀要锋利,不可来回切割,不可挤压组织; 切的组织块要求小而薄 0.5*0.5*0.2CM, 1*1*0.3CM, 1.5*1.5*0.3-0.5,厚度不超过0.5CM. 组织块附加标记 固定 机体死亡或组织离体后，组织细胞由于血液供应停止，组织内蛋白质、糖、脂肪降解，导致组织发生自溶。另外，组织也可因污染细菌而发生腐败。 固定的目的在于保存组织内细胞的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。 固定剂——具有凝固或沉淀组织蛋白的作用，因此能抑制酵解酶类的活动和细菌的繁殖，从而呈现对组织的固定作用。 10%甲醛 处理：组织块一般固定16-24h，长时间亦可，甚至可用来长期保存组织块 冲洗 冲洗：材料自固定液中取出后，需立即冲洗，使其中所有的固定液全部除去，以妨碍染色。 冲洗的方法：组织块放在瓶内，自来水流水冲洗1小时一过夜。 脱水 脱水：脱水的目的在于使组织中的水分完全除去。组织块要在石蜡中包埋，而水和石蜡是不相溶的。必须经过脱水后，才能进入包埋阶段.常用的脱水剂有乙醇、丙酮、正丁醇等，最常用是乙醇。 利用脱水剂吸水的特性，在各级浓度脱水剂中逐渐吸取组织中的水分。 乙醇脱水的过程一般从70%乙醇开始，经80%、90%、95%、100%（二次）而完成脱水过程。 脱水时应注意： (1)每向后转移前，须先将组织块上的液体用吸水纸吸干，以免影响后续乙醇的浓度; （2）在高浓度或无水乙醇中，每级停留的时间不宜太长，否则可使组织收缩变脆，影响切片； （3）如需过夜，应停留在70%乙醇中，也可长期保存，可防止因时间倒不开而影响后续步骤。 透明 透明：因脱水剂与石蜡不相溶，因此在包埋前，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于石蜡的物质——透明剂——起中间置换作用。透明的目的在于使组织中的乙醇被透明剂所代替，以使石蜡能很顺利地进入组织中。另外，还能增强组织的折光系数，故称透明剂。 透明剂的种类很多，常用的有二甲苯、甲苯、苯等。二甲苯为最常用的透明剂，二甲苯能溶于醇及醚，亦为石蜡溶剂，但不溶于水，它的透明力很强。 如果组织进入二甲苯30min以后还不变色，或中心有白色，说明水分未脱净，应返回无水乙醇继续脱水。 透明这一步至关重要，若透明时间不足，则石蜡进不去，不能切片；若透明时间过长，则使组织收缩变脆、变硬，切片易碎。这一步要靠经验。 浸蜡 浸蜡：浸蜡就是将石蜡透入整个组织的过程。石蜡为最常用的包埋剂，有几种不同熔点的石蜡，通常所用的石蜡的熔点为54-58℃。 浸蜡过程：在60℃的温箱内已融化的石蜡中经三次各1h，使石蜡浸透组织。 浸蜡时注意温度不宜过高，浸蜡时间亦不宜过长，否则会引起组织变硬、变脆，影响切片。 包埋 包埋：包埋就是被石蜡浸透的组织连同溶化的石蜡，一起倒入一定形状的器皿（如包埋框、纸盒）中，然后使其凝固成蜡块的过程。 包埋的过程： （1）加热温台及；（2）往包埋框中倒入溶化的石蜡；（3）放入组织块，切面向下，并拨正位置；（4）蜡块凝固。 石蜡切片操作： （1）固定切片刀：刀刃向上，保持水平。调好角度，一般在4-6度。（2）固定组织块。（3）调整所需要的切片厚度：一般在6-10微米。（4）移动持刀器，或拔开齿轮上的牵引钩，前后转动齿轮以移动组织块固定器，调节组织块表面和刀刃的距离，以刚要接近时为止。（5）调整组织块与刀刃之间的角度和位置：组织块的切面及上下边须与刀刃平行。（6）粗切：右手摇轮，左手转动齿轮，慢慢将组织块切到组织本身。（7）切片：右手转动摇轮，转一圈可切下一片，切第二片与第一片连在一起，即成连续切片。左手用镊子或毛笔提起切片的下端，轻轻向自身方向拽，使切片成连续的带状。（8）展片：停止切片，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带跳起，靠刀刃的一面向下，慢慢接触40-45℃的水面，借助水的表面张力使其在水面展开。如有小的皱褶，用小镊子轻轻分开。应注意：水温过高，易使切片全部融化；水温过低，切