DNA分析常见问题及处理.pptVIP

Genecore ABI PRISM? 3700 DNA 分析仪 常见应用问题及处理 全自动 无需配胶 无需灌胶 Polymer in capillary is replenished automatically between runs 自动上样 Samples are automatically loaded into capillary by electrokinetic injection 自动分析数据 Simultaneous data collection and analysis DNA测序技术的应用领域 基因组计划 (未知序列测序) cDNA测序 (全长cDNA和EST) 杂合子测序 SNP分析 突变检测 基于测序的基因分型 电进样原理 毛细管和电极置于样品溶液中 加电压 荷-电的DNA进入毛细管并向毛细管另一端的+极泳动 进样量取决于片段的荷电量及片段大小 毛细管电泳对样品的要求 对样品纯度的要求比板胶电泳高 尽量去净： 残留的盐分 蛋白质 残留的去污剂(如SDS等) 残留的RNA 常用模板制备方法 质粒: 碱裂解法 有可能盐浓度高,伴有杂质 商业性试剂盒 Qiagen Prepman DNA纯度判定 UV分光范围: 0.25 ng / ?l OD260/OD280 = 1.8: DNA纯度好 2.0: RNA污染, RNA酶处理 1.6: 蛋白质 / 酚污染, 酚 / 氯仿抽提 DNA浓度测定 紫外分光法 1 OD260 = 50 ?g / ml ds DNA = 40 ?g / ml ssDNA / RNA = 20 ?g / ml 寡核苷酸 计算示例: 15 ?l DNA原液稀释至3 ml (200倍), 测得OD260 = 0.237, 则 [DNA] = 0.237 x 50 x 200 = 2370 ?g / ml = 2.4 ?g / ?l 引物稀释及浓度计算 1 OD260 = 33 ?g 脱氧核苷酸的平均分子量 = 324.5 引物分子量 = 碱基数×324.5 例：合成量5OD的长20个碱基的引物 分子量 = 20×324.5 = 6490 质量数 = 5×33 = 165 ?g 摩尔数 = 165 / 6490 = 0.025 ?mol = 25 nmol 若溶于500 ?l水中，则浓度为 25 nmol / 500 ?l=50 ?M 常见应用问题解答 序列图谱 原始数据 记录 现象 ：T峰比其他碱基低 原因是测序产物纯化不够 重新分析后的结果 T峰信号低于其他三种碱基 原因：测序产物纯化不够。 解决办法： 电泳前将测序产物以70%酒精洗2次； 将分析起点后移到引物峰后, 重新分析原有数据。 现象2：峰变宽，迁移慢 原始数据比较 峰宽，电泳延迟 解决办法： 电泳前将测序产物以70%酒精洗2次； 将样品室温放置1天，取上层溶液 重新电泳，一般即可恢复正常。 现象: 基线向上弯曲 不影响测序结果 基线弯曲 原因：新毛细管安装时清洗不够，残余有少量杂质。 解决办法： 对测序结果影响很小，使用一段时间后自然消失。 现象：中间丢失数据 现象：N多 测序反应失败 测序反应失败 数据丢失和N多 原因：测序反应失败。 解决办法：改进条件, 重做反应： 引物：与模板之间的比例； 模板：DNA的纯度和用量。 现象8：信号衰减，测序不长 原因：电进样、模板过量导致反应不平衡等因素均可引起信号衰减，是现有测序技术的固有问题。 解决办法： 改用ABI PRISM ? BigDye? Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (BDT v3.1) 目前Genecore使用v3.1 气 泡 原因： 换胶时Online filter中的气泡未驱净或Online filter安装不妥；新安装的毛细管或新仪器的管道中气泡未赶干净。 解决办法： 检查online filter； 运行BubbleRemove.mod和CuvetteFlush.mod。 现象： 绿色带 原因：胶图上所有毛细管有同样迁移率的绿色带覆盖测序峰，样品中有蛋白或其他发绿色荧光的物质污染。 解决办法： 样品用酚/氯仿抽提处理, 然后酒精沉淀纯化。 现象：困难模板测序意外终止 原因：困难模板： GC含量高； 二级结构； 重复序列或序列串。 解决办法