免疫组化显色系统-河北北方学院形态学试验示范中心.PPT

组织学技术第四讲 免疫组织化学法 Immunohistochemistry 河北北方学院组胚教研室 张静 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）： 利用抗原与抗体特异性结合的原理，检测组织中肽和蛋 白质的技术。它是用标记的特异性抗体，在组织或原位 对抗原进行定位、定性或定量检测。 一、实验原理 Ag + Ab Ag-Ab * * 直接法 间接法√ 二、特点： 1、特异性强，灵敏度高； 2、能将形态学改变与功能代谢结合起来； 3、可同时进行定位、定性、定量研究； 4、有较为广泛的应用领域。 三、实验方法 1、实验目的：利用免疫组织化学法检测大鼠胃溃疡 术后胃黏膜组织 TFF3表达。 2、实验背景： TFF3：Trefoil factor family-3 消化道黏膜重要的保护因子 （1） 抗体选择（种属性）： 组织来源为大鼠，检测TFF3抗原表达 一抗选择： 兔抗人、大鼠、小鼠TFF3； 小鼠抗人TFF3单克隆抗体。 二抗选择： 羊抗人IgG； 羊抗小鼠IgG； 羊抗兔IgG； 3、实验准备： （2）试剂配制： ① PBS（phosphate buffered saline ）：磷酸盐缓冲液，pH：7.4 ② 枸橼酸盐缓冲液（pH：6.0) 储存液： A液：枸橼酸 21.01g + 加蒸馏水至1000 ml。 B液：枸橼酸钠 29.41g + 加蒸馏水至1000 ml。 工作液： 0.01M 枸橼酸缓冲液：A液 9 ml + B液 41 ml 加蒸馏水至500ml 4、实验步骤：亲合素—生物素方法 原理图： 一抗与抗原结合 链亲合素三抗-HRP与二抗结合 一抗 生物素化二抗 生物素化二抗与一抗结合 链亲合素三抗 -HRP 辣根过氧化物酶（horseredish peroxidase，HRP)： 稳定性好的标记酶，穿透性强，作用底物H2O2。 HRP + H2O2 + DH2 HRP + D + 2H2O 3’，3-二氨基联苯胺（DAB） 氧化为DAB棕 （1）石蜡切片脱蜡至水。 （2）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。 （3）抗原修复：枸橼酸盐缓冲液热修复（pH：6.0) 微波抗原修复：将切片置入盛有抗原修复液的容 器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在 96℃-98℃之间并维持15-20分钟（自行调整）。 取出容器，冷却至室温（不可将切片从缓冲液中 取出冷却，避免抗原恢复至原有空间构型）。 （4）PBS洗3分钟×3次。 （5）3%H2O2室温孵育10分钟，消除内源性过氧化物 酶活性，PBS洗3分钟×3次。 正常组织、细胞含有内源性过氧化酶，可使 DAB显色，造成假阳性。就用3%过氧化氢 水溶液（30% H2O2稀释10倍）处理切片以阻 断其活性。 （6）切片滴加适当比例稀释的一抗， 37℃孵育1-2小时或4℃过夜 。 （7）PBS洗3分钟×3次。 （8）滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育30分钟。 （9）PBS洗3分钟×3次。 （10）滴加辣根酶标记链霉卵白素（亲合素）工作液 （三抗），37℃孵育30分钟。 （11）PBS洗3分钟×3次。 （12）DAB显色 。 （13）自来水充分水洗，苏木精复染细胞核。 （14）脱水、透明、封片。 正常组大鼠胃黏膜 溃疡术后6天大鼠胃黏膜 TFF3表达（免疫组化法） 四、免疫组化法注意事项 1、根据课题的内容选择动物或人的标本，并选 用配套的Ab。如Ab1为鼠抗人的抗体，Ab2必 须是羊抗鼠。 2、设立对照：阴性对照、阳性对照、空白对照。 3、关于抗体（一抗）稀释度 （1）工作液：无须稀释 （2）原液（浓缩液）： 可选1∶50，1∶100，1∶200预试验。 4、Ab滴片技术 ［注意］滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。 5、Ab孵育必须在湿盒内进行， 以防抗体的蒸发和干片。 5、光镜控制显色方法