第7章 质离体保存.pptVIP

第七章　种质离体保存 几个相关概念（见《园艺植物育种学》） 种质（germplasm）：决定生物的遗传性状，并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质。种质资源包括动植物的个体、器官、组织、细胞甚至控制生物遗传性状的基因。 种质库：又称基因库（GenBank），是以种为单位的群体中的全部遗传物质，它由许多不同基因型的个体所组成。 种质资源（germplasm resource）或遗传资源（genetic resource）：具有种质并能繁殖的生物体。 种质资源保存：为避免种质资源的流失，利用自然或人工创造的适宜环境，实现种质材料生活力的长期保持。 种质资源保存方法 就地保存（自然保护区） 迁地保存（种质圃保存） 种子保存 离体培养保存 基因文库保存 第一节 概 述 一、植物种质资源低温保存的意义 防止物种或品种灭绝 节省人力物力 便于种质资源的国内外交流 二、超低温保存的概念 低温保存（cryopreservation）是由cryo和preservation组成，在 英语中cryo为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。从词义 看，低温所涉及的温度范围是不确定的。 超低温:≤-80℃ 极低温:≤-70℃ (干冰温度) 低温:≤4℃ 超低温保存的优点: 在超低温条件下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，呈现“假死”状态。因此，细胞、组织和器官在此过程中不会发生遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。 在超低温条件下，生命的代谢和衰老过程也基本停止，故能够实现长时期的保存。 超低温保存的意义: 常用的超低温保存方法： 冷冻诱导保护性脱水的超低温保存法 玻璃化处理的超低温保存法 三、超低温保存的研究概况 1．超低温保存技术的发展 2．用于超低温保存的植物材料 3．超低温保存的植物种类 第二节 植物材料超低温冻存的细胞学基础 一、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键 植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的60-90％。细 胞中的水由游离水和束缚水组成，其中游离水约占90％，很容易 冻结，由于细胞内含有许多化合物，因此细胞内溶液并不象纯水 那样在0℃就结冰。 1.细胞内外水分的冻结特性 根据Luyet的冻结理论（1937），细胞内游离水的冻结温度（-30℃）可认为是细胞冻存的安全温度，因而细胞冻存的两步冻结法一般以-30℃为基础的。 也就是说，控制细胞内外水的冻结状态，是细胞冻存技术的关键。 超低温保存的原理 　　为什么在超低温条件下材料不会冻死。关键原因是进行了“防冻处理”，具体如下： 使用冷冻防护剂可以降低培养基和培养材料的冰点。 使用冷冻防护剂可以提高培养基的渗透压，导致细胞发生轻微质壁分离，从而提高了组织和细胞的抗寒能力。 根据细胞内外水分的冻结特性，冻存方法有： 2.低温下细胞的致死损伤 第三节 超低温保存的方法 一、传统的降温冰冻方法 1．慢冻法：以0.5-2℃/min速度降温至-100℃后投入液氮，或以该速度一直降温至-196℃后投入液氮。 在冰冻保保护剂的作用下，既可避免在细胞脱水时细胞内产生冰 晶，又能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应”。因此，对于原生质 体、悬浮培养细胞等细胞类型一致的培养物，这种方法效果最好。 2．快冻法：将材料用玻璃瓶或锡箔纸袋保护后直接投入液氮或液氮的蒸气相中，该方法对高度脱水的材料如种子、花粉及抗寒性很强的休眠枝条或冬芽比较适宜，对含水量高的细胞培养物则不适合。 3．分步冰冻法：是慢冻法和快冻法的结合，先用较慢的速度(0.5 ～ 4℃/min)降至-30～-40 ℃，停留0.5～1h，然后直接投入液氮中保存。停留的目的是诱导细胞外水分结冰，对细胞进行保护性脱水，避免细胞内产生非均一性冰晶。 4. 干冻法：将样品在高浓度(0.5-1.5M)渗透性化合物培养基上培养数小时至数天，再经过硅胶、无菌空气干燥脱水数小时(使含水量降至17～40％)或用藻酸盐包埋后投入液氮保存。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、茎尖、生根苗保存，但不适用于脱水敏感的材料。 二、玻璃化保存方法 玻璃化（vitrification）是指液体转变为非晶体玻璃态的固化过程。 使溶液玻璃化有两条途径：一是大幅度提高冷却速率；二是增加溶液浓度。 1.玻璃化法 玻璃化法是指将生物材料经高浓度玻璃化溶液快速脱水 后，直接投入液氮，使材料连同玻璃化溶液同时转变成玻璃 态。在此过程中，水分子没有发生重排，不形成冰晶，不发 生结构和体积的改变，因而不会对材料造成机械损伤。当保 存终止后，通过快速化冻防止去玻璃化的发生。如果材料能 够安全度过冷却和化冻两个关口，冻存即告成功。 2