脐静脉和骨髓来源的间充质干细胞的比较研究2.docVIP

脐静脉和骨髓来源的间充质干细胞的比较研究* 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(1):6～10 唐晓琼赵智刚王红祥邹萍** (华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所武汉430022) 摘要间充质干细胞(MSCs)的来源有限，成人骨髓是MSCs的主要来源，这极大地限制了其在实验和临床中的应用。为拓宽MSCs来源，从细胞形态、生长特性、免疫表型和多向分化能力等四个方面对人脐静脉来源和成人骨髓来源的间充质干细胞进行了比较研究。结果表明，人脐静脉来源和成人骨髓来源的 MSCs具有相似的生物学特征，成纤维细胞样形态生长，并具有强大的体外扩增和多向分化能力。人脐静脉来源的MSCs可替代成人骨髓MSCs，作为满足实验和临床需要的重要来源。 关键词间充质干细胞骨髓脐静脉 中图分类号Q8131 收稿日期：20050621修回日期：20050921 *湖北省科技攻关计划资助项目(2005AA304B03) ** 通讯作者，电子信箱：zouping@随着基因工程和细胞组织工程的兴起,对于种子细胞的研究成为国内外学者研究的重点。间充质干细胞(mesenthymal stem cells,MSCs)是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，在特定的诱导条件下可以分化成为多种类型的结缔组织，形成骨、软骨、骨骼肌、肌腱和脂肪等多种组织［1］，而且具有采集方便，易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是一种理想的种子细胞。目前用于实验和临床的MSCs来源尚有限，因此，我们分别获取人脐静脉来源和成人骨髓来源的MSCs，体外培养和扩增，比较了二者的形态、生长特性、表面标志、细胞周期、多向分化等特点，为拓宽用于实验和临床的MSCs来源提供实验依据。 1材料与方法1.1试剂 IMDM培养基、胎牛血清、马血清均为GIBCO公司产品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLADR抗体购自 PharMingen。胶原酶Ⅱ、胰酶、乙二胺四乙酸 (EDTA)、1甲基3异丁基黄嘌呤和纤连蛋白购自Sigma公司。 1.2研究对象 8份脐带取自8名足月分娩的健康产妇，5份正常成人骨髓取自5名20～35岁的健康志愿献髓者。 1.3脐静脉来源的MSCs分离培养 无菌条件下取新生儿脐带20~30cm,用无菌生理盐水冲洗，去除脐静脉中的瘀血，以1%的胶原酶Ⅱ注入脐静脉后封闭脐带两端，37℃孵育15min，抽出消化液，用生理盐水冲洗脐静脉2次，以400g离心15min,去上清，计数后以1×105个/cm2的细胞密度接种于含2mol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、10% FCS的IMDM培养液中，置37℃、5%CO2培养箱中，24h后换液，去除未贴壁细胞及杂质细胞。以后每3d换液1次，当细胞达80%融合时，按常规方法以 002%EDTA 0.25%胰酶消化传代培养,取传代3次以上的细胞用于实验。 1.4骨髓来源的MSCs分离培养 经肝素抗凝的成人骨髓,用Dhank’s倍比稀释后,以淋巴细胞分离液(Ficoll,1.077g/ml)梯度离心(400g，20min) ,吸取白环以上细胞部分，用Dhank’s离心洗2次,细胞计数,并以1×105个细胞/cm2接种，在与上述相同的培养条件下进行培养。 1.5细胞生物学特点 1.5.1细胞形态观察分别取第4、7、10代MSCs，置于3.5cm直径平皿中进行细胞爬片培养3d后，瑞氏染色，倒置显微镜下观察染色前后细胞形态。并且取第7代MSCs用2.5%戊二醛4℃过夜固定，经PBS洗涤, 1%锇酸4℃固定1h ,丙酮梯度脱水,环氧树脂Ep0812包埋,常规超薄切片。醋酸铀枸橼酸铅染色,在H2100电子显微镜下观察、照相。 1.5.2细胞生长曲线测定将1×104个细胞接种于24孔板中，置37℃、5%CO2培养箱中，每隔1d取2孔细胞进行计数，计算均值，绘制生长曲线。 1.5.3细胞周期测定将1×106个细胞置于70%冰乙醇中固定20min（4℃），PBS洗涤2次，40μg/ml RNasin中处理20min（37℃），PBS洗涤2次，50μg/ml PI(Sigma,USA)染色5min，用FACS calibur流式细胞仪检测,使用cell quest软件获取并分析数据。 2006, 26(1)唐晓琼 等：脐静脉和骨髓来源的间充质干细胞的比较研究 中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.1 2006 1.5.4MSCs免疫表型分析分别取第4、7、10代MSCs经胰酶消化后，用含20g/L BSA的PBS制成1×106个细胞/ml的细胞悬液。每个上机试管中加入500μl细胞悬液，再加入