dna的蛋白质技术.pptxVIP

DNA与蛋白质的提取 提取DNA利用的是DNA、RNA、蛋白质和脂质的理化性质的差异。具体地说，DNA与其他物质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，再通过冷酒精进一步去除其他杂质。另外DNA对高温和洗涤剂的耐受性较高，不易被破坏。鉴定时可采用二苯胺试剂沸水浴加热呈蓝色来判断DNA的存在。提取与分离蛋白质是根据蛋白质的分子形状和大小，所带电荷的性质和多少，溶解度、吸附性质以及对其他分子的亲和力等理化性质，将不同种类的蛋白质分离开。凝胶色谱法可以将相对分子质量不同的蛋白质有效分离。DNA与蛋白质的提取技术比较电泳法可将带有不同电荷的蛋白质分离。DNA血红蛋白材料选取鸡血细胞等DNA含量相对较高的生物组织哺乳动物的成熟红细胞细胞破碎加蒸馏水、加洗涤剂和食盐搅拌、研磨加蒸馏水和甲苯充分搅拌去除杂质①用不同浓度的NaCl溶液处理②用酒精溶液处理③用蛋白酶处理①透析处理②纯化处理鉴定加入二苯胺，沸水浴SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量PCR技术与凝胶色谱法的比较 PCR凝胶色谱法过程变性：90 ℃以上高温解旋↓复性：50 ℃左右引物与单链结合↓延伸：72 ℃合成子链凝胶色谱柱的制作↓装填：凝胶装填均匀，无气泡↓纯化酶需要热稳定性高的TaqDNA聚合酶不需要酶温度高温常温DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较 试剂质量浓度用途原理NaCl溶液2 mol/L溶解DNADNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在质量浓度为2 mol/L时最大、在质量浓度为0.14 mol/L时最小0.14mol/L析出DNA2 mol/L鉴定时的溶剂酒精95%(体积分数)除去杂质以提纯DNADNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精二苯胺/鉴定剂DNA遇二苯胺(沸水浴)会变蓝色柠檬酸钠0.03 g/mL抗凝剂除去血液中的钙离子，防止血液凝固【典例1】 下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是(　)。试剂操作作用A柠檬酸钠与鸡血混合溶解细胞中DNAB蒸馏水与鸡血细胞混合保持细胞形状C蒸馏水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中析出DNA丝状物D冷却的酒精加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中产生特定的颜色反应解析　在DNA的粗提取与鉴定实验中，柠檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜和核膜破裂；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在质量浓度为0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺(水浴加热)产生蓝色反应。答案　CPCR技术操作注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。(2)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。(3)所有的成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。(4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。(5)PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。【典例2】 PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是(　)。 A．反复洗涤B．用酒精擦洗 C．高压灭菌D．在－20 ℃储存 解析　为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需的试剂从冰箱内拿出，放在冰块上缓慢融化。 答案　C 【例1】 (2011·广东理综，5)下列关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是(　)。 A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢解析　猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少，是提纯血红蛋白的理想材料。提纯血红蛋白分四步：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析，其中洗涤红细胞时，要用生理盐水反复洗涤，既要将红细胞洗涤干净，又要不破坏红细胞，然后再用蒸馏水和甲苯使红细胞破裂，释放出血红蛋白。分离提纯血红蛋白时用凝胶色谱法，是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质，相对分子质量大的蛋白质移动速度较快；血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况，并据此判断分离效果。故D不正确。答案　D【例2】 (江苏高考)下列叙述中错误的是(　)。 A．改变NaCl溶液的浓度只能使DNA溶